上海市临检中心 PCR人员上岗培训班 课件7、高通量测序技术的建立和临床应用 沈茜2016.3.22

高通量测序技术建立及临床应用沈

茜长海医院实验诊断科President

Barack

Obama

January

30,

2015“And

that’s

why

we’re

here

today.

Becausesomething

called

precision

medicine

…

gives

us

oneof

the

greatest

opportunities

for

new

medicalbreakthroughs

thatwe

have

ever

seen.”The

President’s

Precision

Medicine

Initiative(PMI)

Mission

Statement通过研究、技术和政策，使患者、研究人员和供应商共同努力，朝着个性化治疗新的医学时代发展。2015-3-20科学优先级:n

癌症临床试验l

扩大精准医学成功的案例应用n

大型队列研究l

100万或更多的美国人共享研究与健康数据l

推动疾病的精准医学n

标准和资源开发政策重点：n

简化基因组技术的监管审查n

确保足够的隐私保护措施Proposed

FY16

BudgetAgency$

MillionNIH（美国国立卫生研究院），用

于首批志愿者的招募和测序；$

130$

10FDA，在需要协调“精准医疗”项目时，允许其引进相关的技术和专家；国家协调委员会卫生信息技术部用来建立相关标准，致力于保障精准医疗患者的健康隐私和数据信息安全。$

5NIH的癌症研究所，用于解码肿瘤基因及助力开发新的疗法；$

70CFDA卫计委2014.12014.3明确二代测序产品的分类即将发放二代测序试点单位2014.22014.8试点单位评估工作2015.4批准华大基因等NIPT资格加强临床产品的服务监管，叫停无证服务正式批准无创性产筛、遗传性疾病、胚胎植入前筛查和肿瘤诊断4项试点单位。颁发证书2015年3月11日，科技部召开国家首次精准医学战略专家会议，精准医疗计划将在今明两年启动。在2030年前，中国精准医疗将投入600亿元，其中中央政府支付200亿元，企业和地方财政配套400亿元。中国实施精准医学计划的战略意义n

提高疾病诊治水平，惠及民生与国民健康;n

推动医学科技前沿发展，增强国际竞争力;n

发展医药生物技术，促进医疗体制改革;n

形成经济新增长点，带动大健康产业发展。精准医学的组成高通量基因测序和分析疾病发病机制临床疾病分子分型与诊治标记物药物设计靶点临床队列与生物医学大数据明确每一个患者的靶向治疗临床诊断分子检测技术治疗与基因改变匹配靶分子检测和鉴定一、实验室布局要求我们现在的单向通道单向通道PCR室样本制备乳化扩增区区文库构建区试剂准备区缓冲缓冲缓冲测序区单向通道DNA打断区质检室二、组织架构长海医院其他职能部门医教部/医疗科临床科室

临床科室

转化医学中心

病理科病理鉴定及报告审核临床需求病例

测序实验三、岗位配置l

定岗定位收样及测序组

数据分析组

实验报告组明确责认ll

问题回溯样本接收及处理数据分析

1建库报告撰写数据审核病理科主任数据分析

2上机对报告最终审核样本质控数据质控下机数据审核五、人员资质及培训n

实验室管理和技术人员的专业、学术水平、教育培训情况需符合要求；n

测序操作人员需获得仪器操作的培训合格证书；n

除参加外部培训，也建立内部培训机制，对每个人制定培训计划和目标，经岗位操作考核后上岗。姓名专业学历证书郭瀛军遗传学博士

基因扩增PCR上岗证博士

基因扩增PCR上岗证生物信息学、临床医学李

晶喻

东程春燕生物信息学细胞生物学博士博士/NGS应用及操作培训证基因扩增PCR上岗证,遗传咨询师培训李

爽生物科学本科生物化学与分子生物学基因扩增PCR上岗证,遗传咨询师培训徐本梅杨

旭硕士硕士生物化学与分子生物学NGS应用及操作培训证六、技术平台实时备份确保安全有效管理机柜：9个CloudBase

C200刀片节点：40个双路计算刀片计算核心：960+96CPU核ParaStor200超算平台索引控制器集群数据控制CPU：2680-V3

Intel主频2.5GHz刀片理论计算峰值：38.4万亿次网络：56Gbps

FDR

infiniband存储系统：800TB

ParaStor

200

分布式并行文件系统器集群百亿级文件数量EB缓存储容量七、软件和数据库高通量测序数据的处理和分析依赖于各种数据分析软件！数据分析和结果的解读也依赖于多种数据库！知识库支撑软件支撑八、数据管理数据分析及管理设置权限；病人信息及数据专人管理；测序数据按检测项目分别存储肿瘤个体化用药检测项目遗传性乳腺癌易感基因检测项目测序数据直接传到服务器原始数据，可读不可写ParaStor200并行存储系统数据入库直接分析n

下机数据直接上传服务器，无需硬盘拷贝传递n

数据规范化存储，检测项目分类存储n

设置原始数据权限，避免误删误改n

ParaStor200并行存储系统自动实时备份九、质量管理体系程序性管理文件（SMP）标准操作规程（SOP）质量标准文件（QSP）一、检测前乳腺癌易感基因检测项目入组条件乳腺癌易感基因检测乳腺癌患者乳腺癌家族史个体化用药指导病人入组标准：晚期恶性肿瘤，经常规临床治疗无效的患者一、检测前检测项目开展对临床要求n

指定科室n

指定主诊医生n

意义及风险告知n

签署知情同意金钢教授盛湲教授张卫教授胰腺外科主任

甲乳外科主任

肛肠外科主任临床样本的采集、运输及收样样本采集：遗传性肿瘤筛查项目：全血>200µl个体化用药靶向捕获测序项目：病理医师评估富集肿瘤组织，

≥0.5cm3样本运输：采集后的样本立刻送到转化医学中心，采集时间和收样时间之间不超过8h；每次使用前后对生物样本运输盒进行消毒处理。样本拒收：溶血判断：对核酸扩增质量干扰因素脂血判断：对DNA提取质量的干扰样本接收管理样本唯一标识码扫码确认放入规定的试管架临床样本保存时间：2年放入低温冰箱二、室间质评2015NIPT室间质评2015肿瘤诊断与治疗高通量测序检测室间质评促进平台建设原因分析质控品是技术关键n

漏报突变1（EGFR），我们采取Sanger测序法进行验证，干扰了我们的生信结果。n

漏检突变2（PIK3CA），测序覆盖深度比较低，该区域243条有效Reads覆盖，去重后数据为140条Reads覆盖，所以要优化建库条件。上报结果：n

突变漏报n

融合基因漏检n

漏检一个突变（KRAS），后来对平台的方法学验证发现当时流程的检测下限5%MAF，而这个位点仅为1%。三、分析性能验证NGS方法学体系建立的流程图Gargis

AS,

Kalman

L,

Berry

MW

et

al.

(2012)

Assuring

the

quality

of

next-generationsequencing

in

clinical

laboratory

practice.

Nature

biotechnology

30,

1033-1036.验证思路厂家验证项目验证生信验证生信验证参考依据Frampton

GM,

Fichtenholtz

A,

Otto

GA

et

al.

(2013)

Development

and

va

lidat

ion

of

aclinical

cancer

genomic

profiling

test

based

on

massively

parallel

DNA

sequencing.Nature

biotechnology

31,

1023-1031.生信验证参比数据满足性能验证需求l

准确性n

标准答案唯一1000

Genome

Projectl

特异性n

数据质量高n

FM验证合格/l

灵敏性l

线性范围NA07014NA10840NA18595NA18957NA18488NA18511NA18867NA18924NA19108NA19114突变1

突变2

突变

突变

突变534细胞系MAF

MAF

MAF

MAF

MAF100%

50%

30%

10%

5%生信验证n

参比数据n

电子公共数据（electronic

data）ü

Foundation

One

数据n

三大主体分析流程SamtoolsVarscanG

ATKhttp://samtools.sourceforg

http://varscan.sourceforge.

http://www.broadinstitute.o/net/rg/gatkBROADWUSTLBROAD验证流程方法和考察指标优化参数前下载数据/sraGATKVarScan参数优化优化参数后精确性灵敏度验证后的生信分析流程固化生信流程测序原始数据（Fastq文件）数据质控1数据质控2有效数据（Fastq文件）SAM文件BAM文件排序、去重重比对、碱基质量校正VarScan变异检测变异过滤、初级注释、过滤变异位点项目验证肿瘤细胞株湿性实验室干性实验室n

参比序列：已知突变的肿瘤细胞株n

两大主体：湿性实验+干性实验n

方法：基因变异检测n

平台：Life

Ion

Torrentn

指标:

精确性+特异性+线性范围突变结果项目验证参比序列肿瘤细胞株（/）正常人细胞株()在采购少而贵商品化参比序列（/）质控细胞株的选择RL95-2阳性结果BRCA2

p.K2551Ec.7651A>G,

PTEN

p.R173Hc.518G>A,

PTEN

p.M134I

c.402G>TAsPC-1阴性对照-*3阴性样本阴性细胞株理想质控品思考点1：支原体检测*3*3阴性细胞株阴性细胞株混合阳性性细胞株*3*3阴性细胞株阴性细胞株阳性性细胞株l

准确性l

灵敏性l

特异性线性范围混合l4:1=20%;49:1=2%MAF*3阴性细胞株弱阳性样本混合理想质控品阳性性细胞株实验设计测序结果编号RL95-2

AsPC-1样本编号

1000X最低数据量

实际数据量QC101QC102QC103QC201QC202QC203QC301QC302QC303QC401QC402QC40311000111111111QC101QC102QC103QC201QC202QC203QC301QC302QC303QC401QC402QC403300M300M300M300M300M300M300M300M300M300M300M300M659M724M623M525M871M444M682M596M766M569M650M541M1444494949000变异检测结果1:0Sensitivity100%Specificity100%QC101QC102QC103cv值100%100%100%100%灵敏度和特异性统计0:1Sensitivity100%Specificity100%00QC401QC402QC403cv值100%100%4:1Sensitivity100%Specificity75%100%100%QC201QC202QC203cv值00100%100%66.7%100%all0.216262810.157459Sens96%SpecAver97%0.0830.08649:1QC301QC302QC303cvSensitivity100%Specificity100%Stdcv0.

1110.

115100%100%100%100%00四、湿性实验流程及质控要点质控点一：DNA总量＞1μgOD（260/280):1.8-2.0电泳：单一条带质控点二：打断片段：50-250bp，主峰在150bp左右四、湿性实验流程及质控要点质控点三：Pre-PCR:

100-300bp,主峰在200bp左右质控点四：Q-PCR定量：文库稀释到100PM五、生信数据质量控制点质控点

1：有效数据n

若数据质量评估为通过或警告，则表明重测数据质量良好，可以进行下一步分析；n

若数据质量不合格，则需对数据质量进行过滤处理，然后进行重新评估；n

若过滤后仍不合格，则需反馈湿性实验室，要求重测序。质控点

2：比对文件数据量不足：湿性实验补测数据比对质量报告参数实际值参考>400(151)>200(19)靶向区域测序深度253.9397.10%94.80%95.80%5.42%靶向区域覆盖率>95%>90%>95%<20%>99%靶向区域内深度在20X以上的区域靶向区域内深度在10X以上的区域靶向区域内的重复读长的比例靶向区域内特异读长比例99.2%六、报告注释VCF文件输入变异筛选：去除无用或杂乱信息Filter：PASSDepth（DP）>10Func.RefGene：exonicExonicFunc.refGene：去除synonymous

SNV高级注释•

注释信息汇总、去冗余等，得到最终的注释结果。•

撰写检测报告。七、项目开展情况项目一：肿瘤个体化用药检测ClearSeq

Comprehensive

CancerThis

panel

targets

151

key

disease-associatedgenes

that

have

been

implicated

in

studies

of

a

widerange

of

cancers

(eg.

breast,

lung,

colorectal,

AML)and

is

designed

for

deep

coverage

of

ta