DB63T 1908-2021青稞种子纯度SNP分子标记鉴定技术规程

ICS65.020.20CCSB21青海省DB63地方标准DB/TXXXX—2021(报批稿)青海省市场监督管理局发布IDBTXXXXXXXX前言本文件按照GB/T1.1─2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定国科学院西北高原生物研究所提出。海省农业农村厅归口。单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省农作物种子站。文杰、孔豆豆。海省农业农村厅监督实施。1DBTXXXXXXXX青稞种子纯度SNP分子标记鉴定技术规程本文件规定了青稞种子纯度SNP分子标记鉴定相关术语和定义、仪器设备及试剂、溶液配制、KASP与统计、种子纯度计算等技术要求。于青稞品种(系)和种质资源种子纯度检测。范性引用文件，GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GBT43.4农作物种子检验规程发芽试验GBT43.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GBT682分析实验室用水规格和试验方法GBT19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GBT0988多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法定义件。物定时优先选用的一套SNP引物。4仪器设备及试剂本文件所使用的水均为一级水，符合GB/T6682的要求。除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试溶液配制KASP物信息2DBTXXXXXXXXKASP择操作程序1样品准备1.1扦样作复检，另一份用于备份。.1.2发芽GBT3.4的规定进行发芽，发芽籽粒(种子)数需≥50个。.3叶片采取叶一心时，按单株采取真叶进行样品制备。2样品制备按照GB/T19495.3的规定进行DNA的提取。按照GB/T3543.5的规定，每各待检品种制备的DNA样品个单株；单提、单检。GBT中的DNA纯度、浓度测试进行DNA质量检测。SNP：性对照(NTC，即除由等量的超纯水替代DNA样品外，余所加试剂完全一致)。DNA样品尽量往PCR避免放在PCR板的四个角上，每块PCR板尽量只检测一个待检品种。2)依待检样品量按照表1，配制一定体积的KASP基因分型混合液。配制前所有试剂均应短暂地涡的体积；引物原液稀释至10μmol/L。PMastermix5Primer_Allele[FAM]Primer_Allele[HEX]3DBTXXXXXXXXrimerCommon1183)使用微量移液器将步骤2)中的KASP基因分型混合液分别加入到步骤1)已加入DNA样品的PCR视的膜将PCR板密封，然后离心(转速3000rpm，时间30sec)。KASP光定量PCR仪上进行，程序设置见表2。112sec℃3secsec)当数据对应的荧光信号较低，分群较散时，可以增加循环后进行荧光读取，同时保证NTC没有行荧光数据的读取。9数据记录与统计的记为N2；一致性品种也可参照附录D进行判定，根据送检样品在该位点的等位变异进行记录和计数统P数)，按公式(1)计算：P=100%.................................................................(1)N1—一致性品种种子数；N2—不一致性品种种子数。4DBTXXXXXXXXA(资料性)剂A.1主要仪器设备RggA.2主要试剂A.3主要耗材lPCR的膜、一次性丁腈手套。5DBTXXXXXXXX(资料性)BDNA试剂B.1.10.5mol/L乙二胺四乙酸二纳盐(EDTA)(pH8.0)溶液B.1.21mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)(pH8.0)溶液节pH至8.0，定容至50ml。灭菌温度和时间同B.1.1。BDNA取液(见B.1.2)和4mLEDTA溶液(pH8.0)(见B.1.1)，混合均匀，用超纯水定容至400mL。灭菌温度和B存。B0%乙醇mL用超纯水定容至100mL，混合均匀。B0倍DNA溶解液10mLTris-HCl溶液(pH8.0)(见B.1.2)和2mLEDTA溶液(pH8.0)(见B.1.1)，加入50mL超纯水，混合均匀，定容至100ml。灭菌温度和时间同B.1.1，室温保存。6DBTXXXXXXXX(资料性)KASPC1。KASP物序列(5′–3′)ⅠTCAAAⅠMTGTTGCTCCTTCTGCTGCCCPrimerAlleleHEX]:GTTGTTGCTCCTTCTGCTGCCATAGTAGTAⅠCGGTCGCAACACCTGGATTCGGTCAPrimerCommonCGCTGGCAGCTCCAGGGCAAⅠATTCTGGTCAGGTTGAGGAGATTCTTPrimer_Common:AAGGTTGCCAAGCTCAAAAAGGAGAAATTⅠAMCGTCAGCACTGACTGTCCCPrimerAlleleHEXCTCGTCAGCACTGACTGTCCTⅠATCTGGCGGACAGTTATGGAAⅠGGTTCAAAATⅡGeFAMGCGACGCAGCACGACCGAPrimerAlleleHEX]:GCGACGCAGCACGACCGGCGCAGCGCTGGAAH_2ⅡGeFAMGACAAGGCCAGCGGTGCAGTlleleHEXACAAGGCCAGCGGTGCAGCerCommonTCGTGCACGCCAAGACCTCCAAⅡeFAMCCTCCGGTGGCCGGCGPrimerAlleleHEX:GCCTCCGGTGGCCGGCACAGGCTCCCTT7DBTXXXXXXXXKASP物序列(5′–3′)H_2ⅡeFAMCCACCTCCTTCTCCAGCCGTPrimerAlleleHEX:CACCTCCTTCTCCAGCCGCCAAGATGGGCTTⅡⅡleFAMGGCGGCACCGACGCCGPrimerAlleleHEX]:CTGGCGGCACCGACGCCAAGCCCCGCCGGCCATⅡCCGTAGCAGCeHEXCGCCACCCAACCGTAGCAGTTGCCCTAGGGTTTCCCCTTAH_3ⅡAAAGGCGGTCTGATCCTCAAAGGACAGCCATGAAGTTTAⅡGCH_3ⅡTTGCGTGCTCCCACTTGCGTGCTACTCCTCCCACACCCGTATⅡCTCGGAⅡFAMGCCTCAGCCTCCGCCTCAPrimerAlleleHEX:GCCTCAGCCTCCGCCTCCimerCommonCGGAGGCTGAGGCGGAGCATⅡGTAH_4ⅡeFAMGCGTTTCGCCAGCGCACAGPrimerAlleleHEXGCGTTTCGCCAGCGCACACH_5ⅡeFAMGCGCACCGGTGCGTGCTTPrimerAlleleHEX:GCGCACCGGTGCGTGCTCPrimerCommonCCGAAGAGCTCGGCGTCGAAⅡ8DBTXXXXXXXXKASP物序列(5′–3′)H_4ⅡPrimerCommonCAGGAAGGCGCACCGACACTTAⅡACACGAATTGGCAGCTTCAACACGGerCommonTGCTGTCCAGTTTTCAGCTCCTGTTⅡCCTCATCGTCATⅡGTTCTTGATGGCGTCGTCCGPrimerCommonGAAGAAGCGGCCCAAGCAGCTAⅡGTTGArimerCommonGAAAGTCTTCGCAAAAAGTCCGACGAA]中为标记荧光9DBTXXXXXXXX(资料性)物变异位点SNP碱基类型见表D.1。1H_12H_12H_22H_32H_53H_13H_23H_34H_1TRCTMAKCTGGTTGARCYCAKGTGGTTKARCYCAKGTGGTTKTRCYCAKGTGRTCGARCYCAKCTGGTTKARCTCAKGTGRTTGTRCYCAKSYGGTTGTRCYMAKCCGRTTGTRCYMAKSTGGTTKTRYYCAKCCGGTTGTRCYCAKGTGGTCGARCYMAKGTGGTTKTRCYCAKCCGGYCGTRCTMAGCCGGCCGTRCYCAKCCGRCCGTRCTCAKCCGGTCKTRCTCAKCCGGTCGTACTMAKCTGGTTGTRCYMAKCCGRTTGTRCTCAKCTGGTTGARCYMAKCTGRYTGTACTCAGCTGRCTGTACTCAKCTGGTTGCARGGAGCYGGGKTCAGGRARCYGRRGTCAGGRAGCYGRGTTCAGGGAGCCGGGGTCAGGGARCYGRGTTCARGGARCYGRGKTCAGGGAGYYRGGTTDBTXXXXXXXX4H_24H_35H_16H_16H_26H_36H_56H_67H_17H_27H_3CAGGGAGCCGGRTTCAGGGAGCYGGGKTCAGGGAGCYGRGKTCAGGGAGCYGRGTTCAGGRAGYYGGRGTCARGRAGCYGGGKT