定量pcr检测酚氯仿抽提效率

荧光定量PCR检测酚氯仿抽提效率摘要：探讨荧光定量PCR检测sf9细胞内杆状病毒拷贝数测定过程中酚氯仿抽提的效果。方法：用荧光定量PCR检测在酚氯仿抽提DNA的过程中无关DNA(鱼精DNA)对DNA的抽提效果的影响。结果：经过荧光定量PCR检测杆状病毒的拷贝数，在含有50ng/ul无关DNA的检测样品中抽提率为73.6%,在不含有无关DNA的检测样品中抽提率为2.82%；在含有25ng/ul、50ng/ul、100ng/ul、200ng/ul无关DNA的检测样品中抽提率已100ng/ul最为显著结论：荧光定量PCR检测标准液中杆状病毒准确灵敏，可精确的反应出在抽提过程中DNA的抽提效果，与使用传统抽提方法相比，在抽提过程中加入无关DNA可显著提高目的DNA的抽提效率。关键词：无关DNA荧光定量聚合酶链式反应酚氯仿抽提效果Abstract:thispaperstudiestheFQ-PCRdetectionsf9quantitativefluorescenceinsidecellscnsindbisvirusduringtheprocessofdeterminingtheeffectofphenolchloroformextraction.Methods:usingfluorescencequantitativePCRdetectioninphenolchloroformextractionDNAprocessirrelevantDNA(thefishforpureDNA)theextractioneffect.Results:afterfluorescencequantitativePCRdetectionbaculoviruscn,inthe50ng/ulirrelevantcontainingDNAtestingsamplesforextractionrate73.6%,indoesnotcontainDNAtestingsamplesirrelevantfortheextractionrate2.82%;In25ng/ul,containing50ng/ul,100ng/ul,200ng/ulirrelevantDNAtestingsamplesofextractionratehas100ng/ulinthemostsignificantconclusions:fluorescentquantitativePCRdetectionstandardfluidbaculovirusaccuratesensitivetoaccuratelyreflectintheextractionprocessofDNAextractioneffect,andusetraditionalextractionmethodcompared,intheextractionprocesstojoinirrelevantDNAcansignificantlyimprovethepurposeofDNAextractionefficiency.基因组DNA在分子生物学研究中应用广泛。酚氯仿抽提DNA的方法在上个世纪八十年代就已经开始应用，陈子桂在微量提海洋尾丝虫DNA的过程中使用酚氯仿抽提微量DNA效果显著(1)，因其操作简单，实验成本低廉，重复性好，所以在中小规模实验室一直使用。本实验旨在对酚氯仿抽提DNA过程中加以改进，并运用荧光定量PCR检测技术检验，更为精确的计算DNA的准确拷贝数。因在酚氯仿抽提DNA过程中有DNA存在最低检出量(还没有报导过)，但是在低于这个检出量时，抽提效率非常不稳定仅为13.4%(2)，为了解荧光定量PCR检测sf9细胞内杆状病毒拷贝数准确的数量，本实验应用荧光定量PCR技术检测在酚氯仿抽提过程中有无无关DNA及其含量对DNA抽提效率的影响。1.材料与方法材料与试剂杆状病毒测定标准品4.27*107copies/ul、4.27*106copies/ul、4.27*105copies/ul、4.27*104copies/ul、4.27*103copies/u1、无关DNA(鱼精DNA)由西安华广生物公司提供；蛋白酶裂解液、蛋白酶K、酚氯仿DNA抽提液、NaAC、无水乙醇、70乙醇、TE8.0、2.5XSYBRGREENMIX、庆大霉素抗性基因引物、ddH2O均由陕西华广生物公司提供实验仪器伯乐IQ5荧光定量PCR仪方法1.3.1DNA的抽提1.3.1.1DNA的抽提预处理（蛋白酶K消化）1） 蛋白酶裂解液放入37°C水浴中预热5min,并在室温下融化蛋白酶K；2） 取标准品及供试品40ul,分别向其中加入160ul无关DNA或者TE缓冲液，再全部滴加200ul蛋白酶裂解液和蛋白酶K,轻弹混匀后放入37C水浴消化2h（最好过夜）；3） 向上述管中加酚氯仿400ul,剧烈震荡5min；4） 12000rpm离心10min,,取上清，加入1/10体积的3MNaAC和600ml无水乙醇，轻轻混匀后放入-20C冰箱中放置至少2h；5） 12000rpm离心10min,弃上清，用70%乙醇洗沉淀2次，37C恒温箱干燥10min,使沉淀成潮湿状；6） 200ulTE（pH8.0）缓冲液溶解沉淀，充分溶解后置-20C冰箱备用。1.3.2荧光定量PCR检测杆状病毒方法标准品、标本和对照品的处理：将10ul2.5XSUBRGREENMIX庆大霉素抗性基因上下游引物每样12ulddH0混合并将1ul标准品、抽提后的标本及对照品分别加入反应管中，低速离心10s，取出后置于荧光定量PCR扩增仪上。PCR条件为95C3min、95C10s、53.5C30s、68C30s、68C5min40个循环。根据大于引物阴性参照曲线的数据进行定量结果分析。2.结果2.1荧光定量PCR检测有无无关DNA对酚氯仿抽提效率的影响AmpliticationChartfl-HAmpliticationChartfl-H一一丄^£3pllltJEdlqn刀auqssHalCycleStd-1Std-1Std-2Std-2Std-3Std-3Std-4Std-44.27e+064.27e+064.27e+054.27e+054.27e+044.27e+044.27e+034.27e+03Unkn-1Unkn-1Unkn-2Unkn-2Unkn-3Unkn-3Unkn-4Unkn-42.47e+063.82e+061.06e+051.36e+052.37e+064.04e+068.26e+043.56e+04Unkn-5Unkn-6NegCtrl-1NTC-11.18e+022.09e+02N/AN/A图1荧光定量PCR在抽提过程中有无无关DNA(50ng/u1)扩增效果图和数据结果：Unkn-1和Unkn-2分别是40u14.27*107copies/u1+160u150ng/u1无关DNA或TE缓冲液结果,Unkn-3和Unkn-4分别是未知浓度的病毒液40ul+160ul100ng/ul无关DNA或TE缓冲液结果,Unkn-5和Unkn-6是未知浓度的病毒液不经过抽提直接进行荧光定量PCR结果结果显示：由Unkn-1、2已知拷贝数的的标准液在经过添加无关DNA进行抽提后抽提率为73.6%,然而在相同条件下将等量的TE代替无关DNA，抽提率仅为2.82%；由Unkn-3、4、5、6可知添加无关DNA进行抽提的效率是不添加无关DNA抽提效率的54倍,是不经过抽提的病毒原液的1966倍。2.2荧光定量PCR检测无关DNA含量多少对酚氯仿抽提效果的影响AmplificationChartnLL-lxAmplificationChartnLL-lx七ll①言Patjcc-Rqnlzlauzi1113058^onCycle5td-lStd-15td-25td-25td-35td-3Std-4Std-44.27e+064.27e+064.27e+054.27e+054.27e+044.27e+044.27e+034.27e+03Unkn-1Unkn-1Unkn-2Unkn-2Unkn-3Unkn-3Unkn-4Unkn-43.00e+033.90e+033.87e+033.35e+036.22e+041.08e+051.16e+041.68e+04Unkn-5Unkn-5NegCtrl-1NTC-11.56e+011.75e+01N/AN/A图2在抽提过程中添加无关DNA25ng/ul、50ng/ul、100ng/ul、200ng/ul进行荧光定量PCR扩增效果图和数据结果：Unkn-1、2、3、4分别是40ul未知样品+160ul不同浓度的无关DNA，Unkn-5为不经过抽提直接荧光定量PCR结果结果显示：在含有100ng/ul、200ng/ul无关DNA抽提效率明显高于50ng/ul无关DNA抽提效果。3.讨论荧光定量PCR检测是DNA拷贝数的