病毒的形态学诊断

PAGEPAGE13实验十病毒的形态学诊断、培养方法和血清学试验 目的（一）观察病毒包涵体，并掌握其诊断意义。（二）掌握病毒的形态并了解病毒包膜的获得。（三）了解病毒培养的三种方法。（四）掌握病毒学中主要血清学反应的原理（五）熟悉病毒血凝抑制试验的测定过程内容（一）病毒的形态学诊断1.病毒的电镜照片（示教）狂犬病毒包涵体（示教）麻疹病毒包涵体（示教）（二）病毒的培养法（录像）1.病毒的动物接种法病毒鸡胚培养法病毒的组织培养法（三）血凝抑制试验（操作）一、 病毒的形态学诊断 病的诊断一定。方法】（一）病毒的电镜照片（示教）。（二）狂犬病病毒内基（Negri）包涵体（示教）HE（-）意包涵体细胞内的形态、及染色。（三）麻疹病毒包涵体（示教）HE注意包涵体细胞内的、形态、染色以及细胞。二、 病毒动物接种法 ①离鉴如乙②连续传代减弱株致力如③备抗④致病机理的研究。常用的实验动物有小白鼠、地鼠、豚鼠、家兔、绵羊、鸡、猴等。在病毒学研究中，动物接种时为避免动物本身可能带有病毒，多采用实验室自己繁殖的动物。首先根据研究目的选择动物种类，对病毒致病机制的研究，则选择愈接近人类的高等动物（例如灵长类）研究结果愈有价值；其次要注意动物的年龄、性别和接种的途径等各种因素，一般年幼的动物比成年动物对病毒的敏感性高。至于接种的途径应根据病毒的嗜性决定，例如脑炎病毒以脑内注射最敏感。（一）小白鼠尾静脉接种（录像）【材料】动物：小白鼠0.25ml4【】尾（要时用二甲）。尾和根为静脉，可选一根的静脉接种用。左尾的，45°，持注射，于处进静脉，推液 毫升。推遇阻力且隆起发表示不拔重新进；推不阻力且看到由入体而退。逐日观察发情况。（）鼻（）【材料】流肺适株试毛细麻醉乙醚、小玻瓶。【】沾乙醚放入清洁玻瓶抓塞入瓶口进行全麻醉麻醉深度不宜太浅或太深太深易遭麻醉死亡或非特异吸入肺太浅易滴打喷嚏。毛细吸吸取少许同毛细吸插试备用小白鼠握在掌中，大食抓小白鼠耳其朝前并呈仰卧位置，另一取事先吸有病毒悬液的吸，慢慢滴一点于滴口而不其自掉落，悬。悬滴靠近动物鼻尖，动物在呼吸时自吸入，一般为 0.05毫升，不宜过多。慢慢苏醒饲养盒逐日开始发发症状毛耸咳嗽、不食、甚至死亡。解剖尸体可观察到肺炎或性病灶。（）小白鼠脑内接种（录像）【材料】（）再加101013000分钟，吸取上清液供接种用。小白鼠：3周龄，体重6～8克。无菌 0.25毫升注射器及针头（4号）、煮针锅、碘酊、棉签。【方法】以无菌 0.25毫升注射器抽取脑炎病毒悬液 0.1毫升，去除注射器内的气泡。取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指捏住小白鼠的头部，左手手掌轻轻按住小白鼠的体部。右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠颞部皮毛（不碰到眼）。（），，针 2～3毫，不，注射0.02～0.03毫升。注射，将用注射器煮针锅内煮消毒。在 3～4后病，食，，毛，，，。法用脑炎病毒的分离。、 病毒法法用病毒、病毒和病毒的分离、定、、生以及研病毒。和，体，血的分及器的的组织分，病毒病毒的和液体中，病毒；，、无菌的，接种的病毒不生体点，除生的病毒及的病毒，不生的指，必用定病毒的。接（）接种法（）【】病毒 10－3液，10～12龄、无菌 1毫升注射器及 7号针头、磨器、、头小、、碘酒棉、、大头针、无菌、无。【方法】用 10～12龄，在上，根：小血清，小的眼点白和胎盘边界限分明，白边较亮，胎盘边暗红色，果胎盘边黑或苍白都表示已。铅笔标明室位置育区避地记口区丰富呈现红色，卵白尿囊液卵白尿囊液羊水气室卵黄囊（）种（101腔种法录像【材料】10～0～2图。煮沸法放35～37。次日逐日观察生活情况移4。意必须直立前并去4～5。种法适某些呼道如感、副感、新城等培养惟离培养不如羊腔种法阳性率高。10310～13、橡皮乳、眼科剪刀、无培养皿、生理盐水其余同《腔种法。【方法】10～13观察活发育界限。座使其部位部位中部待干即轻轻中三角形窗每许而不使裂同意必须1～2易与粘着。离或锯；或往下压迫个不致损立即橡皮乳2～3目空气斑。绒毛尿囊膜卵白羊水卵黄囊尿囊液斑。绒毛尿囊膜卵白羊水卵黄囊尿囊液10-2 绒毛尿囊羊腔法录像）031273一3不45。感自中出壳扩大便剪绒毛此明亮处清楚地到牛斑呈白色点状有融合堆或片。左手起绒毛尿囊右手剪顺壳四周剪绒毛尿囊入理盐水洗涤 2张斑就得更为清楚。绒毛尿囊法除花外单纯疱疹【材料】副流感0390龄体石蜡其同《尿囊腔接法》。【方法】使直盘使其胎向便操作。铅笔画出和胎位置磨沿边缘和胎位置近处锯方边约 1厘米许3。3挑方壳和管石蜡油少许2石蜡油很快散使透明这样明或清楚地到整。41抽少许流感体直明或羊水气室尿囊液羊水气室尿囊液图 10-3 接种病培养病）5。57262而致死；2死亡者视为特异性死亡流感或副流感病10－3稀释一84减收获。镊以水一般水可一左。滴定水病。一病流感病副流感病流性腮腺炎病等。胞法是目应广种方法其优点是济适结果正确且敏较实验物易于控制胞法应于分离，进行清试验制造疫苗抗原等方面。多胞或流死6内生降等均可作胞培养来源。病感性引起病病特引起病病或感不流性乙型脑炎病敏感。一原代胞培养法【材料】90龄s氏溶％胰酶溶无菌剪无菌皿沉淀无菌胞抗素瓶100无菌玻璃153s1225700501壁温箱孵育般4时附着壁8时长此时即调换接种病二传代胞动经过可胞细胞胞胞胞对病敏感范围较广曾被利病和鉴定如 a－2KB胞HeLa胞对脊髓灰质炎型病腺病大多实验应病都敏感Hep－2胞也曾来离脊髓灰质炎病柯萨奇 A病腺病RS病a来自宫颈癌p－2来自喉癌而B来自腭癌于胞作离用疫苗生产。材料】5片胞生长倒掉Hanks5孵育 1倒下继续孵育 7℃0倒掉原量生长10吹打散胞。生长按原量34倍稀释即能传 4胞接种病病变观察示教）材料】胞Hanks滴和腺病已长二只滴Hanks10.10.11附到上。取出每0.91～2。取出在低倍显微镜下观察注意与形态排列等。注：方便保存此处观察已经过固定和染色。五、血凝抑制试验血凝抑制试验系利血凝素特异性抗体与表面相应血凝素相互血凝现象抑制试验。血凝抑制试验适于具有血凝素试验必须预定血凝，后定4血凝在与血凝定试验相同应下定。血凝定2玻璃板ml移器移头管支、0.5鸡红、生理盐水方法】按下表操程序：将有玻璃板从 号编号从第起直至第 0理盐水 m。将∶5即取ml生理盐水ml取∶5ml第 1混匀吹3从出ml移第 2如直至第 9第 9出m弃消缸内第 10自第 0起向补充生理盐水 m。自第 10起方向每0.5％鸡红球 m摇匀室温静止孔号2））孔号2））病毒稀释度对照123456789222222222+++++++++*222222221603206401280）））各2各4*为1∶5稀释尿囊液111∶0则410。（二）抑制试验【材料】4∶52ml，【方法】按下表进行其操作程序1～109m第0加m。第18∶5m1出ml27第7ml缸内8对照。第17m4第9ml液作对照。5m5孔号12345672222222）＋＋＋＋＋＋＋）*222222血清稀释度1∶101∶201∶401∶801∶1601∶3202红细胞对照2＋*244））各22各4表明功能正常对照底中心，呈钮扣状，表明血清中无凝集因子；测定孔中，如血球沉于孔底中心，呈钮扣状，表明血清中有相应的血凝抑制抗体，为阳性孔；反之凝集者为阴性孔。血凝抑制效价：呈完全血凝抑制时的最高血清稀释度。附录：附录：1病毒的鸡胚培养，多采用来亨鸡卵，其优点为卵壳色白而薄，易于照视，如不能得到，一般家鸡卵也可应用。孵育温度通常在 ～9℃之间，相对湿度 ～0％。孵育 4～5天后即可在检蛋灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。未受精之鸡蛋于 4日后仅见模糊卵黄黑，无鸡胚。的鸡胚于 4日后即可见清之血，中有发育之胚，4～5天后日检查胚情况，日之鸡胚可见到清之上的血及之胚。点，在温度即能发育，中胚，发育。与孵壳，壳的能体子和体子在，因不的，而有的能。的能和，壳之为血的，为，胚，为，胚，之间为中胚，因在发育的能，的在的3的，胚的，，为明体，，后中，胚发育到12～13天，得抗时，通常用稀释后4℃备用，可的沉，尿在鸡胚发育的1113天最高，为 6～6.5。为胚最，胚，有，体于其中，在的，后来蛋白，为 1。卵黄附于胚，卵黄胚的，对培养病毒有用，。2．Hanks。：NaCl 160克KCl 8800OHO 2克·HO 22 21002将上述二溶液混合后加双蒸水至1000毫升，加2毫升氯仿作为防腐剂，保存于4℃冰箱。原液乙：NaHPO·12HO 2 4 2KHPO 克 入800毫升双蒸水2 4葡萄糖 20克0．4％液 10010002用前按以下比例配成。原液甲 1份原液乙 1份双蒸水 18份910413．营养液的配制Hanks液 1000毫升水解乳白蛋白 5克0.59105～10NaHCO。34．0.25％胰蛋白酶溶液配制酶 2.5克使用液 1000毫升青霉素 10毫升（最终浓度100位/毫升）链霉素 10毫升（