菌种筛选和改良

第二节发酵工业菌种本节内容

§1菌种筛选§2菌种改良§1菌种筛选一、常用的工业微生物二、发酵工业菌种分离筛选一、常用的工业微生物1、细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌乳酸杆菌醋化醋杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌丙酮丁醇梭菌谷氨酸棒状杆菌一、常用的工业微生物2、酵母菌酿酒酵母假丝酵母属产朊假丝酵母解脂假丝酵母热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属酿酒酵母热带假丝酵母热带假丝酵母产朊假丝酵母一、常用的工业微生物3、霉菌曲霉属米曲霉黑曲霉青霉属青霉菌：点青霉、产黄青霉桔青霉青霉属产黄青霉曲霉属米曲霉黑曲霉根霉属:德氏根霉米根霉、小麦曲根霉红曲霉属紫红曲霉根霉属米根霉一、常用的工业微生物4、放线菌链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌

5、未培养微生物※定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物。其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99％。一、常用的工业微生物二、发酵工业菌种选育菌株分离：将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。

※（一）菌种选择的要求培养基原料来源广、产物易回收

发酵周期较短；条件易控制；抗病毒（噬菌体）、杂菌能力强；菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不是病原菌（二）自然界工业菌种筛选程序标本采集→预处理→富集培养→菌种分离（初筛、复筛）→发酵性能鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大？如何在后续的操作中使发酵产品可能性实现？目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：→菌种保藏1、采样样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。※采样时应注意的问题:

A、土壤的有机质含量和通风状况

B、土壤的酸碱度和植被状况

C、地理条件

D、季节条件A、土壤的有机质含量和通风状况耕地、菜园、近郊土壤：土质通气保水性能好，微生物生长旺盛，数量多，尤其细菌和放线菌较多山坡上的森林土壤：有机质丰富，微生物生阴暗潮湿，适合霉菌和酵母菌生长沙土、贫瘠的土地：细菌数量少果园：树根土壤中酵母菌含量较高（偏酸）豆科植物根系土壤：根瘤菌较多B、土壤的酸碱度和植被状况腐殖土：霉菌较多油田土壤：分解石油的微生物较多自然环境中的天然菌群，可因人类的生产或生活而改变。如在土壤中加去莠津（2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪），会导致放线菌群的增加；在杀真菌剂存在下，诺卡氏菌属的菌更容易分离到。C、地理条件南方温度高、温暖季节长、雨水多、相对湿度高、植被覆盖面广、土壤有机质丰富：许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大都从南方获取北方：秋季采土样最为理想D、季节条件采土样的方法南方：用取样铲，将表层5cm（阳光直射，蒸发量大水分少，而且受紫外线照射）左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。

北方：土壤干燥，可在10～30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。

富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基或创造有利生长条件，使目的微生物数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离得到所需要的菌株。2、增殖（富集）培养富集的基本方法：

1、控制营养：如以唯一碳源或氮源作底物；

2、控制培养条件：如pH、温度、通气量等；

3、抑制不需要的种类。3、培养分离

从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基；利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素。

从形态的角度

菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。（1）、常规分离法：平板划线法稀释分离法涂布法A分区划线法B连续划线法

将样品分散到最低浓度

倒平板，培养，挑取单菌落

后面3个稀释度各取0.1ml涂布透明圈法变色圈法抑菌圈法生长圈法（2）、生化反应分离法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，这样能分解该底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈。

圈的大小可初步反映该菌株利用底物的能力，完全可以作为菌种初筛的判断标准。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及核酸酶产生菌的分离，产有机酸菌的初筛。

透明圈法例1：分离某种产生有机酸的菌株时，在培养基中添加碳酸钙。例2：分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为唯一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。

变色圈法

例1：分离果胶酶产生菌，用含0.2%果胶为唯一碳源，菌落长成后加入0.2%的刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现降红色的变色圈。例2：分离内肽酶产生菌，除了用酪蛋白作底物平板产生透明圈进行鉴别外，还可用吲羟乙酸酯为底物加到分离培养基内，产生蛋白酶的菌落由于水解吲羟乙酸酯为3-羟基吲哚，后者能氧化生成蓝色产物，根据变色圈便可选出平板上产蛋白酶菌株。若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落的周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，被鉴别出来。抑菌圈法：抑菌圈自动测量分析仪

如，嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品进行保温培养，周围出现生长圈的菌落即为

。嘌呤产生菌常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素等产生菌。其工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株，由于得到所需的营养，凡是目的微生物周围便会出现一个混浊生长圈。

生长圈法：§2诱变育种一、诱变育种二、航天育种自然选育一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察)发酵试验

自然选育是一种简单易行的方法，可达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的。但其突变率很低，因而要采用新方法进行菌株的改良。改良的具体目标提高目标产物的产量提高目标产物的纯度，减少副产物改良菌种性状，改善发酵过程改变生物合成途径，以获得高产的新产品改良的方法常规育种(诱变育种)细胞工程育种基于代谢调节的育种技术基因工程育种蛋白质工程育种代谢工程育种

一、诱变育种

诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质

人工利用各种诱变剂诱发基因突变，再通过适当的筛选方法获得所需要的优良菌种的育种方法，称为诱变育种。

从青霉素产量看诱变育种1945时间1943194319431947195519711977目前发酵单位(u/ml)100250500～850～850～8000～2万～5万5～10万

效价：指有效成分的浓度。1μg/μ

l称为1单位诱变剂

物理的：紫外线、快中子、x射线等化学的：碱基类似物、亚硝基胍、Y啶类物质等{生物的：噬菌体、转座子化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不能宜接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防上污染环境，造成公害。（一）化学诱变剂使用过程的安全性是一种强烈致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例用自来水大量冲洗或用1-2N的NaOH浸泡过夜，洗净。NTG（N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍）是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10％NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。EMS（甲基磺酸乙酯）※（二）诱变育种应考虑的因素1、选择合适的出发菌株合适的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量的菌株。

定义：出发菌株指用于诱变育种的最初菌株或每代诱变的试验菌株，也称亲株。（1）选择出发菌株的要求★对菌株产量，形态、生理等情况了解；★生长繁殖快，营养要求低，产孢子多且早；★对诱变剂敏感；★菌株要有一定的生产能力；★多出发菌株：一般采用3~4个出发菌株，在逐代处理后，将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。出发菌株及生理状态：真菌、酵母106个/ml，放线菌孢子106~107个/ml,细菌108个/ml，细菌选择对数生长期，真菌和放线菌使用幼年孢子，芽孢细菌也可以用芽孢进行诱变处理。力求90%以上为单孢子，制菌悬液用生理盐水或缓冲溶液。（2）出发菌株的选择2、复合诱变剂的使用诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理。复合处理有几类：一类是两种或多种诱变剂的先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。

菌种单独处理复合处理诱变剂突变率(%)诱变剂突变率(%)土曲霉紫外线

X射线

21.3

19.7

X射线+紫外线42.8土曲霉氮芥(0.1%)

紫外线

不明显

4.7

氮芥+紫外线11.0链霉菌紫外线

γ射线

31.0

35.0

紫外线+γ射线43.6金色链霉菌

(2U-84)

二乙烯三胺

硫酸二乙酯

紫外线

6.06

1.78

12.5二乙稀三胺+紫外线

硫酸二乙酯+紫外线

26.6

35.86灰色链霉菌

(JIC-1)

紫外线9.8紫外线+可见光照射1次

紫外线+可见光照射6次

9.7

16.6

剂量的大小常以致死率和诱变率来确定。最适剂量是指能够提高正突变株变异频率幅度的诱变剂量。处理剂量大，致死率高，诱变率也会提高，但达到一定程度后，再提高剂量反而会下降；但诱变剂量也不宜过低，否则很难获得所需的正突变株。致死率90%~99.9%（过去）

70%~80%（现在）。

3、诱变剂剂量的选择4、变异菌株的筛选挑选菌株一般要从菌落形态变异类型着手，发现与产量相关的特征，并根据这些特征，进行筛选、鉴定。一般要经过初筛和复筛两个阶段。如:青霉素产生菌高产突变菌种的筛选初筛：诱变后→稀释→涂布平板→培养→挑单个菌落到斜面→培养→将斜面上的菌落逐个接种到摇瓶→振荡培养→测抗生素效价→超过对照效价10%以上的菌种，进行复筛。复筛：过程与初筛基本相同，不同的是一般将斜面上的单个菌落接种到三个摇瓶中，得出平均效价。复筛可进行1～3次。由此筛选出的高产稳定菌种还要经过小型甚至中型试验，才能用到发酵生产中。（三）诱变剂处理的方式（1）直接处理：将菌悬液用诱变剂直接处理，然后分离。（2）生长过程处理：适用于诱变作用强而致死率低的诱变剂，或只在分裂过程中对DNA起作用的诱变剂，如秋水仙素。这些诱变剂一般都直接加入到培养基中，混匀，倒入平皿制成平板后培养，在生长过程中诱发菌体突变。（3）振荡培养处理：即在摇瓶培养基中加入一定量的诱变剂。菌体随着振荡培养，不断地和诱变剂接触，它们之间的作用远比平板生长过程处理充分得多，所以诱变剂浓度不宜过高。（四）诱变筛选流程

(致死率、突变率、正变率、高产率、投产率)出发菌种斜面

或摇瓶培养24h细菌悬液

稀释涂平板单孢子悬液

诱变处理挑取单菌落200个

摇瓶初筛50株挑出高产斜面

留种保藏菌种传种斜面摇瓶复筛5株挑出高产菌株放大罐试验，中试考查大型投产试验诱变筛选过程中的致死率、突变率、正变率、高产率、投产率二