固相膜免疫测定

关于固相膜免疫测定第1页，课件共28页，创作于2023年2月第十一章固相膜免疫分析技术第2页，课件共28页，创作于2023年2月掌握：免疫印迹试验熟悉：胶体金免疫技术的方法学种类与原理了解：胶体金与免疫金的制备、其他膜载体免疫分析技术第3页，课件共28页，创作于2023年2月一概述二免疫层析试验三免疫渗滤试验四斑点酶联免疫吸附试验五免疫印迹试验六影响固相膜免疫试验的主要因素七固相膜免疫分析技术的临床应用第4页，课件共28页，创作于2023年2月概述固相膜免疫分析技术

(solidphasemembrane-basedimmunoassay)特点:以微孔膜作为固相载体

多孔性,

非共价键高度吸附抗原或抗体易于漂洗第5页，课件共28页，创作于2023年2月第二节免疫层析试验

免疫层析试验原理：以NC膜等为固相载体，样品溶液借助毛细作用在层析条上泳动，同时样品中的待测物与层析材料上待测物的受体（抗原或抗体）发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域，通过目测或仪器检测标记物，在短时间内得到直观的实验结果。

第6页，课件共28页，创作于2023年2月毛细作用是指浸润液体在细管里升高的现象和不浸润液体在细管里降低的现象第7页，课件共28页，创作于2023年2月第二节免疫层析试验

免疫层析试验分为：胶体金免疫层析试验（ICA）荧光免疫层析试验（GICA）

第8页，课件共28页，创作于2023年2月

二、测定模式

（一）胶体金免疫层析试验1、双抗体夹心法测抗原2、竞争法测小分子抗原3、间接法测抗体

第9页，课件共28页，创作于2023年2月胶体金免疫层析试验AGCB双抗体夹心法测大分子抗原（阳性，2个条带）第10页，课件共28页，创作于2023年2月胶体金免疫层析试验AGCB竞争法测小分子抗原（阴性，2个条带）第11页，课件共28页，创作于2023年2月

三技术要点操作要点：（1）将试剂条标记线一端浸入待测标本中2-5s,或在标本加样处加一定量待检标本,平放于水平桌面上（2）在5-20分钟内观察结果结果判断夹心法：阴性:1条棕红色指控条带阳性:出现2条棕红色条带

无棕红色条带出现为试剂失效竞争法：阴性:出现2条棕红色条带。阳性:1条棕红色指控条带第12页，课件共28页，创作于2023年2月

第三节免疫渗滤试验1原理在硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到检测目的。2方法类型双抗体夹心法测抗原间接法测特异性抗体第13页，课件共28页，创作于2023年2月三、试剂盒组成和技术要点

①渗滤装置②胶体金标志物③洗涤液④Ag参照品第14页，课件共28页，创作于2023年2月技术要点：1、平放反应板，于小孔内滴加含待测Ag标本1-2滴，与膜上的Ab反应而结合在膜上2、于小孔内滴加胶体金标记Ab试剂1-2滴，使胶体金标记Ab与结合在膜上的Ag反应3、于小孔内滴加洗涤液2-3滴，待完全渗入，洗去未结合的胶体金标记Ab。4、结果观察：阳性膜中央有淡红色或红色斑点

第15页，课件共28页，创作于2023年2月第四节.斑点酶免疫吸附试验(Dot-ELISA)第16页，课件共28页，创作于2023年2月技术要点：1、抗原包被NC膜吸附力强，包被后封闭。2、抗原抗体反应抗原抗体反应后再加二抗3、确定酶结合物最佳稀释度阴性样品不显色，阳性显色最强时的酶结合物稀释度4、显色反应pH值5.8-6.0时反应最灵敏强阳性蓝黑色斑点

弱阳性淡绿色半点第17页，课件共28页，创作于2023年2月方法学评价：1、NC吸附力强，灵敏度较ELISA高6～8倍；2、可同时检测多种抗体；3、操作简便不需特殊仪器设备4、吸附抗原（抗体）或已有结果的NC膜可长期保存，不影响期活性。第18页，课件共28页，创作于2023年2月

第五节.免疫印迹试验

（immunoblottest,IBT）免疫印迹试验

将凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体反应的高特异性结合.又称Westernblot.是检测蛋白质特性、表达及分布的一种最常用的方法。蛋白免疫印迹试验重组免疫印迹试验第19页，课件共28页，创作于2023年2月

二Westernblot技术要点:1.抗原印迹与包被①（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）②电转移2.抗原抗体反应（间接法）3.检测动画第20页，课件共28页，创作于2023年2月SDS

抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）第21页，课件共28页，创作于2023年2月第22页，课件共28页，创作于2023年2月电转移

将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1-2A），通电45min转移即可完成。此分阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第23页，课件共28页，创作于2023年2月第24页，课件共28页，创作于2023年2月酶免疫定位将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应的条带清晰可辨，并