微波辅助提取栀子多糖的工艺研究大学论文

PAGEPAGE１５微波辅助提取栀子多糖的工艺研究摘要：植物多糖是由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键所组成的化合物，普遍存在于自然界植物体中，其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动的四大基本物质之一，同维持生命功能密切相关。近年来，大量研究表明多糖除了免疫调节、抗肿瘤的生物学效应外，还有抗衰老、降血糖、抗凝血等作用，且其对机体毒副作用小，因此，对多糖的研究已成为医药界的热门领域。目的:以水为提取剂，采取L9（33）正交优化实验，研究了微波辅助提取栀子多糖的工艺，寻求最佳提取工艺。方法：以苯酚-硫酸法测定样品中多糖的含量。结果：最佳提取条件：时间为：20min；固液比：1:30；微波次数：2次，此时多糖的含量为7.61%。关键词：植物多糖；栀子多糖；微波辅助提取；正交实验；提取工艺Abstract:Polysaccharidesofplantbyalotofthesameorwithα-orβ-glucosidechemicalcompoundkeymakeupdifferentmouose.Generallyexistinthenatureplantbody.Itismolecularweightisgenerallyseveraltensofthousandsofevenmillions.Itisoneoffourmajorbasicmateralswithformthelifeactivitywithkeepingthelifefunctioncloselyrelated.Inrecentyears,alargenumberofresearchindicatesthereisimmuneadjustmeatandtheantitumorbiologicaleffectoutsideinexceptmanycandies,havinganti-ageing,lowerthebloodsugarate.Itissmalltothemalicioussideoforganism.sostudyonpolysaccharidesbecomeshot-fieldinthedrugmarker.Object:Bytheexperimentsoforthogonaltest.Themicrowave-assistedextractiontechnologyforgardeniaspolysaccharidewasstudied,withwaterastheextractionsolvent.Lookingforaoptimalextractiontechnology.MethodsThepolysaccharidewasdeterminedbyphenolsulfuricmethod.ResultsTheoptimalconditionofextraction:Theextractiontimewas20minundersolid-liquidratioof1:30,thetimesofmicrowarewastwo.ThetemporalityofGardeniasPolysaccharidewas7.61%.Keywords:Polysaccharidesofplant;gardeniasPolysaccharide;microware-assistantextraction;orthogonaltest;extractiontechnology.1文献综述栀子是茜草科植物山栀GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实,是一种常绿灌木,生于山野间,适应性强,广泛分布于热带和亚热带地区,全世界约有250种。我国有4种,为栀子、海南栀子、狭叶栀子和匙叶栀子。栀子也称黄栀子、山栀子、黄果树、红栀子等。我国栀子资源主要分布于江浙、安徽、江西、台湾等南方各省。栀子尖长椭圆形,表皮有棱,形似古代酒器。有五棱、七棱、九棱等不同品种,中仁深红或黄红色。性苦寒,无毒。入心、肝、肺、胃经。能清热泻火、凉血。主治热病虚烦不眠、黄疸、淋病、消渴、目赤、咽痛、吐血、衄血、血痢、尿血、热毒疮疡、扭伤肿痛。临床用于急性黄疸型肝炎、止血、扭挫伤等疾病。现代研究发现,栀子属植物中含有许多的化学成分,如黄酮类(栀子素类)、环烯醚萜类(栀子苷类)、三萜类(栀子花酸类)、有机酸酯类(绿原酸、藏红花酸类等),另外还含有D-甘露醇、甾醇类、三萜皂苷类、长链烷烃、醇及色素等。在果实和茎叶花中还含有挥发油、多糖等成分。据文献报道，栀子多糖具有比较广谱的抑瘤效应，对腹水肝癌细胞和S-180肉瘤细胞具有较好的抑制作用；另外，还有解热、抗微生物、镇定、保肝、利胆、防止动脉粥样硬化及增强机体免疫力等作用，而栀子多糖是栀子中具有医疗保健作用的主要成分之一，因此对栀子多糖的研究极具价值，为了充分利用栀子多糖有效成分，本课题拟对栀子中多糖提取工艺条件进行探索，预找出最佳工艺条件。1.1多糖研究的目的及意义多糖广泛存在于自然界，是多种中草药的有效成分之一，具有多种生物活性，是理想的免疫增强剂，它能促进T细胞、B细胞、NK细胞、MΦ细胞等免疫细胞的功能，还能促进白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子的产生。目前对多糖的研究方兴未艾，多糖的作用机理以及生物功能与结构的关系的研究不断深入，而且不断有新的多糖物质被发现。多糖是单糖通过糖苷链连接而成的天然高分子化合物，科学研究结果确认多糖作为信息分子在受精、发育、分化、神经系统和免疫系统衡态的维持等方面起着重要的作用。科学研究还证实，自身免疫疾病、衰老、癌细胞的异常增殖和转移、艾滋病毒、病源体感染，各种炎症等生理和病理过程都有多糖类介导。科学研究确认在多细胞生物的细胞外表覆盖着一层糖链，这些糖链参与了细胞面的粘附，在细胞表面形成分支的糖链宛如无线电天线，正是它们在细胞间传递信息，因此，多糖类物质对生命现象的解释，提供十分重要的可靠的依据。为此，当前国际上先进工业国家都投入巨资研发多糖，多糖的研究状况成为反映一个国家生物高科技发展水平的衡量尺度。多糖最为突出而普遍的功能就是其对机体免疫功能的加强。多糖主要通过以下途径而发挥促进免疫功能:（1）提高巨噬细胞的吞噬能力，诱导白细胞介素和肿瘤坏死因子的生成，具有这种免疫促进功能的多糖有香菇多糖、黑柄炭角多糖、裂裥菌多糖、细菌脂多糖、牛膝多糖、商陆多糖、树舌多糖、海藻多糖等;（2）促进t细胞增殖，诱导其分泌白细胞介素，具有这类免疫促进功能的多糖有中华猕猴桃多糖、猪苓多糖、人参多糖、刺五加多糖、枸杞子多糖、芸芝多糖肽、香菇多糖、灵芝多糖、银耳多糖、商陆多糖、黄芪多糖等;（3）促进淋巴因子激活的杀伤细胞活性，这类多糖有枸杞子多糖、黄芪多糖、刺五加多糖、鼠伤寒菌内毒素多糖等;（4）提高b细胞活性，增加多种抗体的分泌，加强机体的体液免疫功能，这类多糖有银耳多糖、香菇多糖、褐藻多糖、苜蓿多糖等;（5）通过不同途径激活补体系统，有些多糖是通过替代通路激活补体的，有些则是通过经典途径，这类多糖有酵母多糖、裂裥菌多糖、当归多糖、茯苓多糖、酸枣仁多糖、车前子多糖、细菌脂多糖、香菇多糖等。多糖对人类健康有举足轻重的作用，它能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。它还具有调节免疫的功能，是当今已知的最佳的免疫增强剂、促进剂和调节剂，在免疫障碍引起的疾病上用途广泛，它不但能防止癌症对免疫系统的严重损伤，而且能防治多种由于免疫缺损的疾病和慢性病毒性肝炎、反复呼吸道疾病、病毒性感冒和由耐药细菌引起的久治不愈的结核病，临床证明多糖还能显著地防止经链霉素一利福平治疗后肺结核的复发。在生命科学研究领域里，糖生物学一直是该领域的研究前沿和热点。国外近期的研究表明，参与细胞与细胞、细胞与基质相互作用的主要细胞粘附分子绝大多数是糖缀合物，尽管目前对糖链在细胞识别和粘附分子中的作用仍未完全阐明，但生物体内的这些细胞粘附分子的重要性和药用潜力已展现出巨大的诱人前景。如1990年发现的E-Selectin，即血管内皮细胞-白细胞粘附分子，能识别白细胞表面唾液酸化的四糖分子SLex,当组织受到损伤或感染时，白细胞与内皮细胞粘附，然后沿壁滚动穿过血管壁进入受损组织以杀灭入侵的病原体。再如癌细胞的转移、病原体的感染等过程也是通过糖蛋白的介导，而糖链参与其识别和粘附。国外曾报道通过某些多肽或糖类化合物进行阻断实验性肺癌的转移，取得了一些可喜进展，当然要达到临床应用尚有较大距离。国内近20年来对大量中草药来源的多糖及糖缀合物，如黄芪多糖、牛膝多糖、猪苓多糖以及枸杞子糖缀合物等近百种多糖进行了化学和广泛的活性研究，相继报道了这些多糖及糖缀合物具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖等多方面的药理作用，有的已在临床应用。１.2国内(外)研究现状及分析早在上世纪四十代，多糖就开始作为药物，而到了六十年代，由于其作为广泛的免疫促进剂引起人们的极大兴趣，开发多糖的保健食品与药物也倍受重视。多糖不仅在许多方面具有药用价值，而且作为药物其毒性极少。对不同来源多糖的生理活性和提取纯化的研究已取得了很大的成功，当前国内外正致力于活性多糖的作用机理和构效关系的研究，并取得了一定进展。近二十年来，由于分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能，多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等，都有着密切的关系。多糖在医药上还是一种很好的佐剂。近年来又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性作用。此外它还能控制细胞的分裂和分化、调节细胞的生长和衰老。多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。因此，在开展多糖资源的开发、多糖结构的分析、多糖药理作用等的研究方面，人们做了大量的工作。多糖是来自高等植物、动物细胞膜、微生物细胞壁中的天然大分子物质，是所有生命有机体的重要组成部分，并与维持生命所需的多种生理功能有关。但就其研究状况而言，糖类尽管也取得了巨大的进展，但与蛋白质和核酸的飞跃式发展相比，显得远远落伍。对多糖的研究，最早是在20世纪40年代，其中研究得较早且最多的，是从细菌中得到的各种荚膜多糖，它在医药上主要用于疫苗。但多糖作为广谱免疫促进剂而引起人们的极大重视则是在20世纪60年代。尤其是近二十年来，由于分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能，并且相继多次召开了有关“糖生物学和糖工程”的专题会议，1984年，苏联人在荷兰召开的第十二次国际碳水化合物讨论会上报道了用全合成特定结构的荚膜多糖作疫苗，受到与会者的极大兴趣。尔后，有关真菌多糖的研究更为深入和广泛，如酵母菌多糖、食用菌多糖，特别是食用菌多糖的研究，报道数量较高，其中以香菇多糖研究得较清楚。日本将香菇多糖、云芝多糖:ps—k投入市场之后，并取得了显著的效益。1995年3月，亚洲分子生物学组织（ambo）还在日本举办了“糖生物学和糖工程”培训班，也就是说，“糖生物学的时代正在加速来临”。多糖具有储藏能量、结构支持和抗原决定性等多种生物功能，多糖及糖结合物的分离，纯化和组分测定及结构分析有了长足进展。同时，对多糖的生物学功能有了新的认识。80年代以来，科学家们对植物多糖，特别是对中药中的多糖研究产生了浓厚的兴趣，至今已相继报道了100多种具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗感染、降血糖等多种生理活性的中药多糖，有的已在临床用于肿瘤、肝炎、心血管等疾病的辅助治疗和康复，其中最重要的药理作用当推免疫促进作用。已有的大量药理和临床应用表明，这些功能确切的多糖，其原生药大多属于补益类中药，如人参多糖、黄芪多糖的原生药人参、黄芪均是知名的补气中药；当归多糖、阿胶多糖的原生药当归、阿胶是最具传统的补血中药等等；还有牛膝多糖(Achyranthan,Abps)，近来的药理研究和临床应用均表明其具有显著的免疫增强作用，它的原生药牛膝是具有“强筋骨、治腰膝酸麻”功效的传统中药，而这些功效无不与免疫功能有关。至今中药免疫调节剂绝大多数是免疫促进剂，而其有效成分为多糖或糖缀合物，包括糖肽、蛋白多糖等。我国研制的天然植物多糖提取技术——从多种中草药才中提取活性多糖的纯度已达98%以上，这是我国在生命科学的重要领域“活性多糖”的分离、纯化，分子结构确定及量效关系控制方面取得的重大突破，步入生命科学前沿达到世界领先水平。特别引起医学界关注的是多糖类物质能激活巨噬细胞、T淋巴细胞、B细胞等，以加强抗体，达到抑制和消灭肿瘤细胞的效果。多糖还可促进胰岛素的分化，养活肝糖原的量，多糖被人体消化吸收，只需极少量的胰岛素参与，绝不会加重胰岛素的负担。因此，多糖可防止糖尿病并发症，1990年日本专门报道多糖可作为眼球晶体疾病并发症的防治药，可防治糖尿病引起的视网膜破裂；多糖也能明显降低血脂、胆固醇、血压。多糖所具有的活性和免疫性以及极少具有副作用，是理想的天然、安全、有效的药品和保健食品，为人类健康展示了光明的领域，为此，科学家们称21世纪为多糖世纪。目前全球至少有12种多糖分别用作抗肿瘤药物正在进行临床试验。近年来又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性作用。此外，多糖还能控制细胞的分裂和分化、调节细胞的生长和衰老。多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。因此，在开展多糖资源的开发、多糖结构的分析、多糖药理作用等的研究方面，人们做了大量的工作。目前，多糖的研究以日本、美国、德国、俄罗斯等国处于领先地位，我国的科学家们也做了不少工作。尤其是植物多糖方面，由于我国是中药的起源之地，而糖类是中药材中普遍存在的成分，在对各种中药材的化学成分研究的过程中，人们都少不了对其中多糖的关注。当前，国内外正致力于活性多糖的作用机理和构效关系的研究。随着人们对环境保护意识的增强，回归自然已经成为人们日常生活中的一种追求。亚健康状态概念的提出，国家对医疗制度改革政策的出台以及生活水平的提高，促进了人们在观念上的转变，即由过去以治病为主的观念逐渐向防病为主的观念转变，这为天然多糖的开发应用提供了广阔的前景。中药是我国的医药宝库，中药现代化是中药发展的必由之路，而天然多糖的研究无论是在药学方面还是在药理学方面都已取得了明显的进步，它的深入研究和开发将成为中药现代化的一个典范。2实验部分2.1实验原料、仪器和药品2.1.1实验原料山栀子（新疆石河子市中药店）2.1.2实验仪器722N可见分光光度计、粉碎机、电热套、万分之一天平、循环水式多用真空泵、电热恒温鼓风干燥箱、微波提取器（松下电器）、过滤装置、各种容量瓶、量器、各种移液管(各种规格)、分液漏斗、三角烧瓶、过滤装置等。2.1.3实验药品葡萄糖(AR,105℃干燥至恒重)、苯酚（RA）、浓硫酸（RA）乙醇（95%）、石油醚、乙酸乙酯、丙酮2.2实验方法和步骤2.2.1微波提取条件的确定2.2.1.1微波时间对栀子多糖提取的影响控制电流表读数在60-80mA,水与栀子的液固比为10:1,微波一次，应用不同的微波处理时间，对栀子多糖提取进行研究，结果见图1图SEQ图表\*ARABIC1微波加热时间与栀子多糖溶液吸光度的关系由图1可见，微波加热时间≤21min时，随着微波加热时间的延长，栀子多糖溶液的吸光度增加；但是加热时间≥21min后，随着加热时间的延长，栀子多糖的吸光度下降。这可能是较长时间的微波处理产生过高温度，引起多糖的破坏。由吸光度可以看出，微波加热21min栀子多糖含量较高。2.2.1.2微波次数对栀子多糖提取的影响控制电流表读数在60-80mA,水与栀子的液固比为10:1，微波加热时间为20min,应用微波处理不同的次数，对栀子多糖提取进行研究，结果见图2。图SEQ图表\*ARABIC2微波次数与栀子多糖溶液吸光度的关系由图2可以看出，随着微波次数的增加，栀子多糖溶液的吸光度逐渐增加，但微波3次后就增加的不明显了。综合考虑成本，微波次数最好应在2-3次。2.2.1.3水与栀子的液固重量比对栀子多糖提取的影响控制电流表读数在60-80mA，微波加热时间为20min，微波2次，研究不同的液固重量比对栀子多糖提取的影响，结果见图3。图SEQ图表\*ARABIC3液固重量比与栀子多糖溶液吸光度的关系由图3可以看出，在一定范围内，液固重量比越大，栀子多糖溶液的吸光度就越大，液固重量比在≥25:1后，增大不明显。综合考虑成本，液固重量比在以25:1-30:1为宜。2.2.2标准曲线的制备葡萄糖标准溶液的配制:精密称取干燥恒重葡萄糖25.2mg，加适量水溶解，转移至250ml容量瓶中，加水至刻度摇匀，配成为100.8μg/ml标准葡萄糖溶液备用。5%苯酚标准溶液的配制取苯酚100g，加铝片0.1g和NaHCO30.05g,蒸馏，182℃出现大量馏分。快速称取7.5g馏分，加适量水配制成5%的苯酚溶液，置于深色瓶中放入冰箱内备用。标准曲线的制备准确量取葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml置于干燥的大试管中，分别加水至1ml，再分别加入5%的苯酚1ml，摇匀，然后加浓H2SO45.0ml，充分摇匀，室温放置30min至常温，在490nm处测其最大吸光度值。序号1234567V(ml)0.10.20.30.40.50.60.7C(μg/ml)10.0820.1630.2440.3250.4060.4870.56A0.0780.1630.2450.2890.3650.4380.547数据处理得回归方程：A=0.0074C+0.0069(r=0.9915)葡萄糖标准曲线图2.2.3换算因素的测定栀子粉碎后，称取100g，置于锥形瓶中，依次用250ml石油醚、乙醚和80％乙醇超声提取两次，反应时间各20min，减压抽滤、残渣挥干溶剂后，继续以水超声提取两次，40min／次，减压过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至一半体积，加入0.1%活性炭，脱色两次，过滤。滤液加4倍量的95%乙醇，放置过夜，抽滤后的沉淀以100ml水溶解，重复沉淀一次，过滤，残渣用乙醚、无水乙醇反复洗涤。60℃干燥，即得栀子多糖。精确称取60℃干燥恒重的栀子多糖20.00μg，水溶解后定容到100ml容量瓶中，摇匀做为多糖储备液。精确量取多糖储备液0.2ml，加水至1ml。按测定标准曲线同样的方法测定其吸光度A=0.295按下式计算换算因素：f=W/CD式中，W为多糖重量（μg），C为多糖液中葡萄糖的浓度（μg/ml），D为多糖的稀释因素换算可得f=1.027。2.2.4正交实验的设计表1因素水平列表因素A微波时间（min）B微波次数/次C固液比（g/ml）11511:2022021:2532531:30根据此正交实验将对栀子中多糖的提取工艺进行研究。2.2.5栀子多糖的提取称取一定量的粉碎的栀子，根据前面所设计的正交实验，设计如表2中的九组实验。准确称取9份一定量的栀子粉，置于烧瓶中，用95%的乙醇浸泡，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9。分别放入微波提取器，用一定量的95%乙醇回流15min,控制电流60-80mA。抽滤，提取器再用一定量乙醇回流15min,控制电流60-80mA。抽滤，充分洗涤，滤液移至500ml容量瓶中，定容、摇匀。再稀释一定倍数，以测标准曲线同样的方法测其吸光度A，按下式计算多糖含量：多糖含量（%）=CDf/W×100式中C为样品溶液中葡萄糖的浓度(μg/ml),D为多糖的稀释因素,f为换算因素,W为样品的重量(μg)。表2(L933)正交实验最佳条件列表实验号ABC多糖含量（%）11115.6721226.2531336.9142126.7252237.6162316.0373135.7283215.6593325.64K118.8318.1117.35K220.3619.5818.61K317.0118.5820.24κ16.286.045.78κ26.796.536.20κ35.676.196.74极差值1.120.490.96因素主次ⅠⅢⅡ较优水平6.796.536.743结果与讨论栀子多糖微波辅助提取最佳提取工艺组合为：A2B2C3，即微波辅助时间为20min,微波次数为2次,固液比为1:30。微波提取中对栀子多糖含量影响次序为A>C>B。各因素间影响差异无显著性。中草药的提取有许多种方法，但常用的提取方法(如煎煮法、回流法、浸渍法、渗漉法等)在保留有效成分，去除无效成分方面，存在着有效成分损失大、周期长、工序多、提取率不高等缺点。近10年来，在中药提取方面出现了许多新技术、新方法，这些新技术和方法的应用，使得中草药提取既符合传统的中医理论，又能达到提高有效成分的收率和纯度的目的。如：超临界流体萃取技术、超声提取技术、微波萃取技术

、

酶法、半仿生提取法

、破碎提取法等等。使用微波萃取技术主要是由于微波萃取工艺与传统萃取的工艺比较有以下优点：

1、可以选择性的将能量作用于物质的有效成份上，提高产品纯度。

2、设备体积小，造价低廉。

3、能耗量低，仅为家用微波炉的6倍电耗。

4、减少操作步骤，缩短生产时间。

5、减少废弃物的排放量。

6、加热、控制能量的输出迅速。

目前，微波萃取在对农产品加工，中药提纯，香料萃取等已经取得巨大的经济效益。可以毫不夸张的说，微波提取（萃取）为广大化工、医药、农业的高新技术企业及科技工作者开辟出广阔的潜在市场。参考文献[1]张晓静，刘会东,植物多糖提取分离及药理作用的研究进展［Ｊ］,时珍国医国药,２００３,１４（８）:４９５．[2]王晨明,植物多糖的药理作用［Ｊ］．中国药业,２００２，１１（１１）:７３－７４．[3]阴健,郭力弓,中药现代研究及临床应用[M].北京:学苑出版社,1993:471-471.[4]郭霖,王桂云,王迪等,茜草科药用植物药理作用研究概述[J],中医药信息,1994,11(1):37-37.[5]杨基森,张永萍,谢珊,近年来中药提取工艺研究概论[Ｊ].贵阳中医学院学报,1999,21