氨基酸发酵生产知识背景

子情境：氨基酸发酵生产技术-知识背景

氨基酸（aminoacids）广义上是指既含有一个碱性氨基又含有一个酸性羧基的有机化合物。但一般的氨基酸，则是指构成蛋白质的结构单位。即其氨基直接连接在α-碳原子上，这种氨基酸被称为α-氨基酸。氨基酸 氨基酸结构特点：除脯氨酸外，都属于L－α氨基酸。除R是H（甘氨酸）都具有旋光性（＋，－），同种氨基酸构型相反旋光性也相反。每种氨基酸都有特殊的结晶形状，可用来鉴别氨基酸。氨基酸在中性pH时，α氨基和羧基以离子形式存。从蛋白质水解得到的α-氨基酸（除甘氨酸外）都是L-型的。1、根据侧链R基团的化学结构脂肪族氨基酸：最多芳香族氨基酸杂环氨基酸杂环亚氨基酸2、根据侧链R基团是否有极性(在pH7左右时)非极性R基氨基酸不带电荷的极性R基氨基酸带正电荷的R基氨基酸（组氨酸R基pH7附近解离）带负电荷的R基氨基酸氨基酸的分类中性氨基酸:酸性氨基酸：Asp、Glu碱性氨基酸：Lys、His、Arg4、根据人体能否自身合成必需氨基酸：Val，Leu，Ile，Thr，Met，Lys，Phe，Trp非必需氨基酸：其余5、非蛋白质氨基酸：不组成蛋白质，以游离或结合状态存在于生物体内。这些氨基酸多数是蛋白质中存在的L-型a-氨基酸的衍生物，如鸟氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、高半胱氨酸等。但也有一些是β-丙氨酸、r-氨基丁酸。这些氨基酸虽然不参与蛋白质组成，但在生物体种往往具有一定的生理功能。氨基酸的分类1、氨基酸的物理性质溶解性氨基酸由于其结构上存在着极性基团，所以一般氨基酸（除胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸外）都溶于水。脯氨酸极易溶解于水，故易潮解不易制成结晶。绝大多数氨基酸难溶于乙醚等有机溶剂（脯氨酸溶于乙醇、乙醚）。故可用有机溶剂沉淀法制备氨基酸。熔点α氨基酸都是无色晶体，每种氨基酸都有自己特有的结晶形状，可用于鉴定。与相应的有机酸比较，氨基酸的熔点一般都较高（常在230℃—300℃之间，如甘氨酸的熔点为232℃，而相应的乙酸的熔点为16.5℃），熔融时即分解放出CO2。氨基酸的性质味感：氨基酸的味感与其立体构型有关。L-型氨基酸有甜、苦、鲜、酸等四种味感。大米的香味是由胱氨酸地存在，啤酒的苦味是由于三个支链氨基酸的存在。旋光性在这20种氨基酸中除甘氨酸外，所有的氨基酸都具有不对称碳，因此都具有旋光性。氨基酸的紫外吸收性质两性解离和等电点氨基酸的性质（1）与水合茚三酮的反应氨基酸的化学性质氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。（2）与甲醛的反应氨基酸的化学性质反应特点A.为α-NH2的反应B.在常温，中性条件，甲醛与α-NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。应用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法（间接滴定）A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。氨基酸的化学性质(3)非酶促褐变氨基酸与还原糖在一定条件下可发生美拉德反应生成类黑色物质。美拉德反应在食品共业中有着重要的应用，但同时也可能降低食品中蛋白质和氨基酸的营养价值。氨基酸的化学性质(4)与金属的鳌合反应氨基酸可与许多金属离子发生鳌合反应，如：Cu2+、Co2+、Mn2+、Fe2+。食品工业中，可以利用该反应来制备保健食品，如氨基酸鳌合钙。氨基酸的化学性质(5)成盐反应氨基酸分子中的氨基和羧基可分别与酸和碱成盐。味精即为谷氨酸的一钠盐。氨基酸的作用与用途 1、构成人体基本物质之一 2、在医疗工业中的应用 3、在食品工业中的应用氨基酸的生产方法发酵法：直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。添加前体法氨基酸的生产方法酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。菌株的育种从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件.在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。随着重组DNA技术的发展,接合、转导、转染、细胞融合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方法构建生产菌株的尝试。随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生产。用野生株的方法这是从自然界获得的分离菌株进行发酵生产的一种方法。典型的例子就是谷氨酸发酵。改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵用营养缺陷变异株的方法这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生物合成在中途停止，不让最终产物起控制作用。这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。类似物抗性变异株的方法用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。体内及体外基因重组的方法基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体，在两条DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性重组现象。细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础上，应用重组DNA技术可以改变代谢途径分支点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代谢网络。其主要步骤为:鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶);取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点(增强活性或稳定性、解除反馈抑制等);将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节元件一起克隆进目标生物;使调节元件的作用及培育条件最优化。4、搅拌的影响搅拌的作用是使液体不断地翻动，使温度和pH保持均匀，以有利于晶体长大，避免晶簇的形成。但搅拌速率不能太快，液体翻动太激烈，对晶体长大不利，促使晶体细小。 搅拌太慢，液体翻动过慢，温度和pH不均匀，造成局部pH过低，易形成细微的晶核甚至轻质谷氨酸。搅拌速率与设备的直径和搅拌叶大小有关，设备越大，搅拌器的转速也应适当降低，其转速以30r/min左右为宜。谷氨酸的结晶氨基酸发酵的代谢控制控制发酵的条件控制细胞渗透性控制旁路代谢降低反馈作用物的浓度消除终产物的反馈抑制与阻遏作用促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成控制发酵的条件专性需氧菌，控制环境条件可改变代谢途径和产物。控制细胞渗透性生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞面内外的渗透压而泄露出来。控制旁路代谢降低反馈作用物的浓度利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸的量。消除终产物的反馈抑制与阻遏作用使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法。促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成ATP的积累可促进氨基酸的生物合成氨基酸发酵的工艺控制培养基pH温度氧氨基酸发酵的工艺控制---培养基1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烃碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的发酵操作决定碳源种类氨基酸发酵的工艺控制---培养基2、氮源：铵盐、尿素、氨水；同时调整pH值。营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加有机氮源水解液。需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。可分批流加。氨水用pH自动控制连续流加氨基酸发酵的工艺控制---培养基3、合适C/N氮源用于调整pH。合成菌体生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的C/N高。氨基酸发酵的工艺控制---培养基4、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时糖代谢受抑制。5、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。6、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。氨基酸发酵的工艺控制---培养基7、钠：调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入。8、锰：是许多酶的激活剂。9、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进谷氨酸产生菌的生长。10、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害作用。氨基酸发酵的工艺控制---pH对氨基酸发酵的影响及其控制作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。控制pH方法：流加尿素和氨水流加方式：根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。氨基酸发酵的工艺控制---pH对氨基酸发酵的影响及其控制控制：（1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免pH过高（2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。（3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。（4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。氨基酸发酵的工艺控制---温度对氨基酸发酵的影响及其控制菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的。菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高，糖耗慢，周期长，酸产量低。采取措施：少量多次流加尿素，维持最适生长温度，减少风量等，促进菌体生长。氨基酸发酵的工艺控制---氧对氨基酸发酵的影响及其控制要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA循环有关。适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产量最大。供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵谷氨酸生产工艺产生菌株特点：革兰氏阳性不形成芽胞没有鞭毛，不能运动需要生物素作为生长因子在通气条件下才能产生谷氨酸。谷氨酸生产工艺谷氨酸生物合成机理：由三羧酸循环中产生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性氨化作用而得到。谷氨酸生产工艺一、淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解1、调浆：干淀粉用水调成10-11Bx的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8％至pH1.5。2、糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80℃下中和。3、中和：烧碱中和，至pH4.0-5.04、脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6-0.8％，在70度及酸性条件下搅拌后过滤。谷氨酸生产工艺酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行液化，85℃30min，加糖化酶60℃糖化24h，过滤后可供配制培养基。谷氨酸生产工艺糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加中青霉素。谷氨酸生产工艺二、菌种扩大培养1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2琼脂培养基，32℃培养18-24h。谷氨酸生产工艺2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。1000ml装200-250ml振荡，32℃培养12h。3、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1％，用水解糖代替葡萄糖，于32℃进行通气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为108-109/ml。谷氨酸发酵1、适应期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。不产酸。12h。措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，在pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度30-32℃谷氨酸发酵3、菌体生长停止期：谷氨酸合成。措施：提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4。大量通气，控制温度34-37℃。4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。发酵周期一般为30h。谷氨酸发酵控制（1）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在，进而影响磷酯的合成。当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，你谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。谷氨酸发酵控制（2）种龄和种量的控制一级种子控制在11-12h，二级控制在7-8h。种量为1％。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老自溶，后期产酸量不高。（3）pH。发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低，菌体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵慢，长菌不长酸。谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2，转氨酶最适pH7.2-7.4。在发酵中后期，保持pH不变。过高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。谷氨酸发酵控制（4）通风：不同种龄、种量，培养基成分，发酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏，抑制菌体生长。在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，以防过量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风，则大量积累a-酮戊二酸。防止噬菌体和杂菌的污染从空气过滤、培养基、设备、环境等环节严格把关。谷氨酸发的提取1、等电点法：操作简单，收率60％。周期长，占地面积大。2、离子交换法：用阳离子交换树脂提取吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱，收集相应流分，再加盐酸结晶。谷氨酸发酵研究新进展继续选育各种生化突变菌株：转化率提高，或可在富含生物素的培养基中保持较高产酸水平。提高原料利用率，拓宽原料来源或简化操作工艺。生物工程新技术的应用：体外DNA重组的基因工程和原生质体融合技术和固定化细胞技术使产量提高近1倍。改进发酵工艺：开拓原料，改进流加工艺，通过电子计算机控制发酵条件。非糖质原料的谷氨酸发酵醋酸发酵谷氨酸机理：醋酸形成乙酰CoA，再进入TCA，因此凡能利用葡萄糖原料的菌种也可作为醋酸发酵谷氨酸的菌株。以醋酸钠或醋酸铵与醋酸的混合液为原料，且浓度不超过4％。发酵过程中也需流加以保持pH。一.谷氨酸的检测1.原理： 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。谷氨酸检测一.谷氨酸的检测2.试剂与材料（1）标准氨基酸溶液：配制