免疫组化技术

关于免疫组化技术第1页，课件共87页，创作于2023年2月第一节免疫组织化学理论基础

一、免疫反应

免疫组织化学技术以免疫学的抗原抗体反应为理论基础。

（一）抗原

抗原是一种化学物质，能刺激机体免疫系统产生相应的抗体，并能在体内和体外特异性结合形成抗原-抗体复合物。抗原具有免疫原性和反应原性，免疫原性指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性，反应原性指抗原分子与抗体或效应T细胞等免疫应答物质发生特异性反应的特性。抗原可以是可溶性物质（如毒素或蛋白质）或微粒（细菌或组织细胞）。第2页，课件共87页，创作于2023年2月T细胞B细胞AgTBT浆细胞致敏T细胞抗体第3页，课件共87页，创作于2023年2月

1．抗原的性质

（1）异物性：机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质产生免疫应答，该物质与机体的种系关系越远，其免疫原性越强，机体的免疫反应也越强。同种异体物质也可作为抗原，如人红细胞ABO血型抗原，人类白细胞组织相容性抗原（HLA）。第4页，课件共87页，创作于2023年2月

1.免疫原性

指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答(产生特异性抗体及免疫效应细胞)的性质。

AgTBT浆细胞致敏T细胞抗体第5页，课件共87页，创作于2023年2月2.反应原性(又称免疫反应性)

指抗原分子与免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)发生特异性结合的性质。AgTBT浆细胞致敏T细胞抗体第6页，课件共87页，创作于2023年2月第7页，课件共87页，创作于2023年2月第8页，课件共87页，创作于2023年2月

（2）大分子胶体：抗原分子量越大，其表面积越大，接触免疫细胞的机会越多，在体内停留时间长而不易排除，因而对机体的刺激作用也越强。一般具有免疫原性的物质，分子量常在10000以上。小于5000~10000的蛋白质分子，免疫原性很弱或完全没有。

（3）特异性：一种抗体只能与相应的抗原反应而不能与其他抗原反应，这种抗原称为特异性抗原（specificantigen）。不同的抗原物质常含有共同的抗原成分，即一种抗体可以与二种或二种以上不同抗原反应，这些抗原称为共同抗原（commonantigen）。第9页，课件共87页，创作于2023年2月

3．抗原的种类分类方法很多。根据抗原的性质分为完全抗原和不完全抗原：

（1）完全抗原：同时具有免疫原性和反应原性的物质，能在体内诱导免疫应答，产生效应物质，并可与产生的效应物质特异性结合，如细菌、蛋白质等。

（2）不完全抗原或半抗原，指在体内单独存在时时免疫原性、但能与相应抗体特异性结合的低分子化合物或化学基团。能与半抗原结合使其具有免疫原性的蛋白质部分称为载体（carrier），载体使结合物具有免疫原性，半抗原决定结合物的特异性。第10页，课件共87页，创作于2023年2月

3、完全抗原与半抗原

1）完全抗原（completeantigen)具有免疫原性和反应原性的物质。

2）半抗原（hapten，又称不完全抗原incompleteantigen），无反应原性，只有抗原性的物质。半抗原+蛋白质→完全抗原第11页，课件共87页，创作于2023年2月半抗原

+载体抗体BT完全抗原BBBT第12页，课件共87页，创作于2023年2月2．抗原决定簇（AD）概念：抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称为表位AD的数目、性质和空间构象决定抗原特异性抗原以AD与相应抗原受体及抗体特异性结合第13页，课件共87页，创作于2023年2月

（二）抗体机体的免疫活性淋巴细胞在抗原的刺激下成为致敏淋巴细胞，进而分化、增殖为记忆细胞和淋巴母细胞，后者再分化为浆细胞，产生和分泌相应的抗体。根据抗体发挥功能的不同可以称为凝集素、调理素和沉淀素等。

1．抗体的性质

1972年，国际免疫学联合会正式将化学机构与抗体相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白（Ig）。人类Ig有IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，五种Ig都具有IgG的基本结构。IgG分子有4条对称的多肽链，两条轻链（L链）和重链（H链），以共价和非共价二硫键连接组成，通常用L2H2表示。多肽链的氨基(N)

第14页，课件共87页，创作于2023年2月末端的氨基酸组成及序列随结合抗原的特异性而异，称可变区（V），是与抗原结合的部位，也称Fab段；羧基（C）末端的氨基酸组成及序列比较稳定，称为稳定区（C），是与Fc受体结合的部位，也称Fc段。

2．抗体的产生抗原初次进入机体后，首先被抗原呈递细胞（APC）如巨噬细胞吞噬，经消化降解保留其有效的抗原决定簇（特异性抗原成分），并呈递给T淋巴细胞。

T淋巴细胞受到抗原信息刺激后，活化、增殖、分化为效应T细胞，同时分泌大量细胞因子，辅助B细胞活化、增殖、分化为浆细胞，合成和分泌抗体。第15页，课件共87页，创作于2023年2月

3．抗体的种类根据获得抗体的途径或来源不同，分为免疫抗体、天然抗体和自身抗体。根据抗原与抗体在试管内是否出现肉眼可见的免疫反应，分为完全抗体和不完全抗体。（三）抗原抗体反应抗原与抗体在体内进行的反应称为免疫反应，在体外进行的反应称为血清学反应，二者统称为免疫学反应，具有高度的特异性。主要有凝集反应、沉淀反应和补体参加的各种血清学反应。抗原与抗体所形成的抗原抗体复合物不是靠化学共价键结合，而是抗原决定簇与抗体分子的抗原结合位点的相互吸引，同时还有静电引力、范德华力、氢键、疏水键等参与。第16页，课件共87页，创作于2023年2月所以，抗原抗体复合物的结合不仅具有特异性，而且结合得十分稳定，二者在复合物中仍可保留各自原有的结构和化学特性，只有在特殊条件下才能解离，如低pH高浓度盐（3mol/L硫氢化钾，7mol/L尿素）。在免疫组化操作过程中，已形成复合物的抗体不可能被缓冲液从组织中洗脱，所洗去的只是未结合的或结合后多余的抗体。一个抗体分子有两个抗原结合位点（二价），但一个抗原分子可有多个结合位点（多价），抗原与抗体的反应不受数量比例的限制，但要出现肉眼可见的反应，抗原抗体需保持一定的比例。第17页，课件共87页，创作于2023年2月

二、免疫组织化学基本技术方法不同的免疫组织化学技术各有独特的试剂和方法，但基本技术方法是一致的，一般包括抗体制备、标本处理、免疫染色、对照实验和显微镜观察等。

1．抗体的制备高敏感特异性抗体是免疫组织化学技术的首要条件。抗体有单克隆抗体和多克隆抗体两大类，目前已商品化。新购买的抗体应根据生产厂家提供的效价分装保存，在-20℃~-70℃冰箱中可保存1~2年。小量抗体最好一次用完，避免反复冻溶，以免降低效价。第18页，课件共87页，创作于2023年2月

2．标本的处理标本的采集和处理是免疫组织化学技术成功的前提，要保证待检组织新鲜，选用合适的固定液及时固定、切片等。

3．免疫染色由于在组织和细胞进行的抗原抗体反应一般是不可见的，需要用标记方法将某种标记物或荧光素结合到抗体上，再用组织化学方法显示此标记物或在荧光显微镜下观察荧光素发出的荧光。用这些标记的抗体可以在组织切片上鉴别是否发生了特异的抗原抗体反应，并可对与抗体结合的抗原进行定位。第19页，课件共87页，创作于2023年2月

三、结果判断对免疫组织化学结果的判断应持科学慎重的态度。要准确判断阴性和阳性，排除假阳性和假阴性结果以及非特异性染色，必须严格对照实验。

1．阳性细胞的染色特征

有胞浆、胞核和胞膜表面着色三种类型，大部分抗原位于胞浆，可见于整个或部分胞浆；阳性细胞可呈灶性和弥漫性分布；因抗原含量不同，染色强度不一，如细胞之间染色相同，常提示为非特异性染色；阳性细胞定位于单个细胞，且与阴性细胞混杂分布，而非特异性染色常波及一片细胞；切片边缘、刀痕、皱摺，坏死重叠细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的染色强度，不能用于判断阳性。第20页，课件共87页，创作于2023年2月

2．染色失败的常见原因

通常有以下几种：（1）均一阴性：可能是操作步骤，抗体质量，相关试剂质量，pH等出现了问题。（2）均一弱阳性：可能是抗体浓度过高或温育时间过长，H2O2浓度过高或显色反应时间过长，缓冲液未加NaCl或pH有误，粘片剂太厚等因素。（3）背景过深：可能是未用酶处理切片，切片过厚，漂洗时间不足，显色反应过长，封闭血清不足或血清溶血，全血清抗体稀释不够等因素。（4）阳性对照良好，待检切片阴性：标本固定和处理不当是最常见的原因。第21页，课件共87页，创作于2023年2月第二节免疫荧光组织化学技术

一、免疫荧光的基本原理免疫荧光组织化学技术系将抗体或抗原以荧光素标记，然后与相应抗原或抗体结合，在荧光显微镜或紫外线照射下，呈现荧光的一种特异性免疫荧光检测方法。该技术结合了免疫反应的特异性和在黑色背景中发光物质易被发现的敏感性优点，因而能准确检测少量的抗原或抗体成分在组织细胞内的定位分布。第22页，课件共87页，创作于2023年2月

二、免疫荧光技术的条件（一）荧光素

当某些物质经光线的照射，特别是经短波长的光线(能量强)照射后，该物质原子的电子层中的电子吸收光能，由低能级的电子层跃迁到高能级的电子层，或跃迁到同一电子层的高能带，称为能级跃迁。处于高能级状态的电子极不稳定（激发态），经过约10-8秒后，以辐射光量子的形式释放所吸收的能量，而回到原来的能级状态（基态）。这种辐射出的能量即荧光。引起荧光最有效的光是激光、紫外光和蓝紫光。根据不同荧光素的标本，可产生红、橙、黄、绿、青、蓝、紫色的荧光。第23页，课件共87页，创作于2023年2月

荧光素是一种染料，可以吸收激发光的光能并发射荧光。一定的荧光素可以与组织或细胞的某些成分（如染色体）中的分子或功能基团进行特异性结合，呈现一定颜色的荧光。荧光显微镜就是利用组织和细胞与荧光素特异性结合的特性，通过激发滤光片产生一定波长的激发光源，照射结合在组织和细胞中的荧光素产生激光，再通过阻断滤光片观察所产生的荧光。即可观察组织细胞的结构、细胞内某些成分含量的变化，并探讨细胞的功能状态。或用某些荧光素标记免疫球蛋白，进行免疫荧光细胞学研究。第24页，课件共87页，创作于2023年2月用于标记蛋白质的荧光素必须具备有①化学上的活泼基团，易与蛋白质稳定结合；②能发射可见的、对视觉敏感的荧光颜色；③荧光效应强，性质比较稳定，不影响标记物的活性。常用于免疫标记的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）、四乙基罗丹明（RB200）、二甲基氨基萘-5-磺酸（DANS）、4-乙酰胺-4'-异硫氰基-二苯乙烯-2',2'二磺酸（SITS）呈兰色荧光、得克萨斯红、藻红素R、花青，DANS因荧光迅速猝灭，已很少用。第25页，课件共87页，创作于2023年2月（二）荧光标记抗体

用于荧光素标记的蛋白质，多用特异性抗体或抗原成分，因不同抗原的理化特性差别甚大，不易高效标记，远较标记抗体少。用于标记的抗体要求效价高，特异性强，标记后活性损失小。虽然单抗的效价高，特异性强，亲和力强，但经荧光素标记后，理论活性仅是标记前的50%，故常用标记抗鼠免疫球蛋白的方法以弥补单抗标记的缺点。

1．FITC标记抗体

FITC为黄橙色或黄褐色粉末或结晶，分子量389.4，性质稳定，室温可保存2年以上，低温可保存多年，易溶于水和乙醇。最大吸收光谱490～495nm，最大发射光谱520～530nm，呈现黄绿色荧光。第26页，课件共87页，创作于2023年2月在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与IgG的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，结合成为标记荧光素的IgG荧光抗体。一个IgG分子最多可以标记15~20个FITC分子。

2．TRITC标记抗体

TRITC为紫红色粉末，分子量580，较稳定。最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰。与蛋白质结合方式同FITC相似。TRITC亦分无定型和结晶型两种，前者与蛋白质以20~40μg/mg为宜，后者则为12.5μg/mg。第27页，课件共87页，创作于2023年2月

3．RB200标记抗体

RB200为褐红色粉末，分子量580，不溶于水，易溶于乙醇或丙酮，性质稳定，室温下可长期保存。最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595~600nm，呈现明亮橙红色荧光。RB200在PCl5作用下转变成磺酰氯（SO2Cl），在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸-氨基反应而标记在蛋白分子上。

（三）荧光抗体的贮存合格的荧光抗体，加0.1%硫柳汞防腐。小剂量分装于安瓶内熔封后，4℃保存1年，-20℃保存2年，冷冻真空干燥成干粉后熔封，4℃保存5年效果尚好。

第28页，课件共87页，创作于2023年2月三、免疫荧光技术的分类：据标记的抗体和抗原不同分为荧光抗体法和荧光抗原法，以荧光抗体法较为常用。据标记的抗体不同又分为直接法和间接法

1．直接法用荧光素直接标记已知的特异性第一抗体（或抗原），检测相应的待测抗原（或抗体），本法简便、快速、特异性强，但敏感性差。第29页，课件共87页，创作于2023年2月第30页，课件共87页，创作于2023年2月2．间接法间接法不需直接标记特异抗体(一抗），而是标记第二或第三抗体。

（1）夹心法：先用特异性抗原与组织内的抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在组织内抗体上的抗原结合，抗原夹在组织抗体与荧光抗体之间，故称为夹心法。（2）检测抗体法：用已知抗原的组织切片，加上待测血清，其中的特异性抗体与切片中的已知抗原结合，再用间接荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体必须用抗人IgG荧光抗体）。在荧光显微镜下就可以第31页，课件共87页，创作于2023年2月见到抗原抗体反应部位呈现特异性荧光。此法是常规检测血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。（3）检测抗原法：先用特异性抗体与标本中的待测抗原反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（二抗）与结合在抗原上的一抗结合，形成抗原-抗体-荧光抗体复合物。本法只需要制备一种种属间荧光抗体，不但简便快速，而且特异性强、敏感性高。第32页，课件共87页，创作于2023年2月第33页，课件共87页，创作于2023年2月3．补体法（1）直接检测组织内免疫复合物：用抗补体C3等荧光抗体直接作用于组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，形成抗原-抗体-补体-抗补体荧光抗体复合物，在抗原-抗体-补体复合物存在的部位呈现特异性荧光。（2）间接检测组织内抗原：将新鲜补体与一抗混合，同时加在抗原标本上，37℃孵育后如发生抗原抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原-抗体-补体-荧光抗体复合物。第34页，课件共87页，创作于2023年2月利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光第35页，课件共87页，创作于2023年2月

四、常用荧光染色方法1．直接法

(1）向切片滴加最佳效价的荧光标记一抗，室温或37℃避光作用30min；（2）倾去残留的荧光一抗，浸入PBS(pH7.2~7.4)，电磁振动，洗涤5min×2次；（3）蒸馏水洗涤1min除去盐结晶；（4）用50%缓冲甘油封固（0.5mol/L碳酸缓冲液，pH9.0~9.5），荧光显微镜观察。（5）对照实验：1）抗体对照：用正常血清代替荧光抗体血清，如上述方法处理，结果应为阴性；

2）抗原对照：类属抗原染色，结果应为阳性；第36页，课件共87页，创作于2023年2月

2．间接法（1）向切片滴加最佳效价的一抗，室温或37℃避光作用30min；（2）倾去残留的一抗，用0.1mol/LPBS（pH7.2）洗涤10min×2次，吸去残留液体；（3）滴加间接荧光抗体，室温或37℃避光作用30min，PBS振动洗涤10min×2次；（4）50%缓冲甘油封固（0.5mol/L碳酸缓冲液，pH9.0~9.5），荧光显微镜观察。（5）对照实验：1）抗体对照：用正常血清代替一抗血清，如上述方法处理，结果应为阴性；2）阳性对照：用阳性对照切片染色，如上述方法处理，结果应为阳性。第37页，课件共87页，创作于2023年2月

3．补体法（1）将固定切片（涂片）0.1mol/LPBS（pH7.2）洗涤3min，吹干至表面无水分；（2）滴加最佳效价免疫血清和补体的等量混合液，室温或37℃避光作用30min；（3）用0.1mol/LPBS（pH7.2）洗5min×2次，搅拌或振动，吸干标本周围液体；（4）滴加最佳效价的抗补体荧光抗体，37℃避光作用30min，水洗同（3）；（5）蒸馏水洗涤1min，50%缓冲甘油封固，荧光显微镜观察。（6）对照实验：按间接法对照进行。第38页，课件共87页，创作于2023年2月

五、免疫荧光染色的注意事项

1．载（盖）玻片载玻片必须光滑均匀，无自发荧光，厚度以0.8~1.2mm为宜，盖玻片以0.17mm为宜。

2．组织切片不宜太厚，以免激发光消耗过多和细胞重叠影响观察，通常5~10m。

3．封片剂必须无自发荧光，无色透明。通常用甘油。

4．荧光观察暗室中观察，每次1~2h为宜。荧光强度分四级，“--”无或微弱自发荧光，“+”明确可见的荧光，“++”明亮的荧光，“+++”耀眼的荧光。采用高速感光胶片（ASA200）摄影，或采用分光光度计、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜和图象分析仪观察、记录、分析。第39页，课件共87页，创作于2023年2月

六、非特异性染色的消除方法

1．非特异性染色的主要因素（1）部分荧光素未与蛋白结合而形成聚合物或衍化物，不能被透析除去而着色。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，与组织成分非特异结合。（3）除待检抗原外，组织中可能存在类属抗原（如Forssman抗原），可能与组织中特异性抗原以外的相应抗体结合。（4）所制备的免疫血清混杂一些抗其他组织成分的抗体，混淆不清。（5）荧光素分子太多，过量标记的抗体分子带有过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色，荧光素不纯、标本固定不当也可出现非特异性染色。第40页，课件共87页，创作于2023年2月

2．非特异性染色的消除方法

根据非特异性染色的原因，通常采用下列方法：（1）动物脏器粉末吸收法：常用猪或鼠肝粉或骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加肝粉50~100mg，混允，室温振动2h，4℃过夜，再搅拌10min，3000~15000rpm高速离心30min，1~2次，即可使用其上清液。一般在临用前进行，吸收后荧光抗体低温保存不要超过2周。（2）透析法：荧光素（如FITC）可以透过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，因此，透析法可以将未与抗体蛋白质分子结合的荧光素除去。

第41页，课件共87页，创作于2023年2月（3）伊文蓝（Evanblue）衬染法：用含0.01%伊文蓝的0.01mol/L（pH7.2）PBS溶液稀释荧光抗体，可将背景组织染成红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明对比，减少非特异性荧光，宜常规使用。伊文蓝配成1%溶液，4℃保存，用前稀释至0.01%以稀释抗体。（4）其他：葡聚糖凝胶G-25或G-50层析法和DEAE纤维素柱层析法、荧光抗体稀释法、纯化抗原和纯化抗体法、胰蛋白酶消化组织切片法、牛血清蛋白封闭法等。第42页，课件共87页，创作于2023年2月第三节免疫酶标组织化学技术免疫酶标记技术是在免疫荧光技术的基础上发展起来的。通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，当抗原与抗体在组织或细胞内特异性结合后，借助酶对相应底物的特异催化作用，生成有色不溶性产物（或高电子密度颗粒），在光镜（或电镜）下进行细胞表面或细胞内各种抗原成分的定位、定性和定量检测。第43页，课件共87页，创作于2023年2月一、标本制备基本原则是保持组织内抗原物质的不动性和免疫活性。1．AMEX（acetonemethenzoatexylene）即改良冷冻置换法（freezesubstitution）的简称，主要用于石蜡包埋的标本，具有同新鲜未固定组织冷冻切片同样的抗原保持性和石蜡切片的良好组织结构保存性。其机制为：组织在丙酮中固定（脱水），细胞内水分逐渐被丙酮取代，继而用苯甲酸酯取代丙酮，经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织在-20℃丙酮内过夜亦形成冰晶，所以将组织先置4℃丙酮20~30min，再移入-20℃丙酮过夜，也可以在4℃丙酮内过夜，效果基本相同。第44页，课件共87页，创作于2023年2月2．微波固定能保持良好的组织结构和抗原性，适用于各种切片固定。其机理可能与微波的频率具有被水分吸收的性质（通常所用微波频率2450MHz）有关。生物材料含有大量水分，照射后分子运动加快，温度升高，促进固定液向组织内渗透，加速与组织成分的反应，短时间内可达到固定的效果。经微波照射固定的组织，需置于相同固定液中，室温下后固定2~6h。通常为固定液5~10ml，照射10~30s，照射后固定液的温度≤50℃。具体方法：将标本置于微波炉转台中央，周围放一烧杯盛300~500ml纯水，以吸收照射时微波炉产生的热量，选择强档照射10~30s。3．切片冷冻切片和石蜡切片，各有优缺点，根据具体情况选择第45页，课件共87页，创作于2023年2月

二、染色方法（一）酶标抗体染色方法

1．标记酶理论上讲，用于组织化学方法显示的酶均可用于标记抗体，但实际上能用于标记抗体的酶只有少数几种：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP），分子量40kD；碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP），分子量80kD；葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase，GOD），分子量180kD。理想的酶首先必须具有催化底物的特异性和反应产物的稳定性，同时应具有分子量小、可溶性好、光密度高、偶联方法简便，与抗体偶联后仍保持酶的活性，与底物作用后容易显色，而且不易退色等特性。第46页，课件共87页，创作于2023年2月

HRP广泛分布于植物界，以植物辣根内含量最多而得名，系无色的酶蛋白与深棕色的铁卟啉结合组成的糖蛋白，糖占16～18%（8条糖链分布在HRP分子表面），最适pH=5～5.5，最适温度40～45℃。pH4～11、50℃以下较稳定，易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。酶的活性中心含有铁卟啉辅基，最大吸收光谱403nm。目前认为，HRP是一种比较理想的标记酶，但生物体内某些组织和细胞（如退化变性坏死组织，红细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞等）内也有内源性HRP，因此，标记切片中可出现非特异性着色，影响对结果的判断分析。然而，正常哺乳动物的组织中（或心脏经灌注后）不含HRP，不出现非特异性染色，故标记切片背景清晰。第47页，课件共87页，创作于2023年2月2．酶标抗体酶标抗体与荧光素标记抗体不同，需要借助偶联剂将酶连接在抗体分子上。偶联剂是一种双功能试剂，必须具备3个基本特征：与抗体和酶之间必须是不可逆共价键结合；不能影响酶和抗体的活性；不能因偶联剂的加入，使酶标抗体与组织成分发生特异性结合。HRP标记抗体的常用偶联剂有戊二醛、对萘醌、过碘酸钠和Maleimide等。第48页，课件共87页，创作于2023年2月3．基本原理根据酶标抗体的不同，分为直接免疫酶标法和间接免疫酶标法。（1）直接免疫酶标法（directimmunoperoxidasemethod）：是通过HRP直接标记的第一抗体与抗原结合，形成酶标免疫复合物而显色。本法简便，但每种抗体均需与HRP偶联，而偶联过程会降低抗体的效价，故不及直接免疫荧光法简便，已很少应用第49页，课件共87页，创作于2023年2月组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法（一）直接法原理：HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原---抗体●HRP复合物第50页，课件共87页，创作于2023年2月步骤：一步完成优点：简便、省时特异性强，非特异染色轻缺点：敏感性差一种标记抗体只能检测一种抗原第51页，课件共87页，创作于2023年2月（2）间接免疫酶标法：是用HRP标记二抗，有抗原放大作用，较直接标记法敏感。当特异性一抗（多数抗血清由兔制得，单克隆抗体由小鼠制备）与抗原形成复合物后，再加HRP标记的二抗，形成抗原-一抗-HRP标记二抗复合物而显色。由于二抗体实际就是一抗体的抗体，所以，只要不同的一抗来源于同一种属，与标记的二抗结合就能显示其不同特异性抗原的存在，避免了直接法标记每种一抗的麻烦，而且提高了敏感性。第52页，课件共87页，创作于2023年2月组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法（二）间接法原理：HRP标记在第二抗体上，抗原---特异性抗体---第二抗体●HRP复合物第53页，课件共87页，创作于2023年2月组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法（二）间接法原理：HRP标记在第二抗体上，抗原---特异性抗体---第二抗体●HRP复合物第54页，课件共87页，创作于2023年2月优点：较直接法敏感性高

一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原缺点：

较直接法费时非特异性染色稍重

步骤：二步法第55页，课件共87页，创作于2023年2月优点：较直接法敏感性高

一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原缺点：

较直接法费时非特异性染色稍重

步骤：二步法第56页，课件共87页，创作于2023年2月4．显色原理（1）HRP标记显色：HRP是最常用的标记酶，其显色原理如下：

HRP+H2O2←→HRP·H2O2+供氢体（电子供体）

HRP+H2O+供氢体（氧化型）HRP的特异性底物为H2O2

，在分解H2O2过程中，与H2O2形成复合物，无电子供体存在时，反应再进行，有电子供体存在时则迅速生成水，酶被还原，电子供体被氧化、聚合，再经氧化环化后形成吲哚胺多聚体。红外光分析表明，这一多聚体进一步氧化环化形成苯乙阱聚合体，在酶反应部位形成不溶性棕褐色沉淀，与组织对比清晰。第57页，课件共87页，创作于2023年2月第58页，课件共87页，创作于2023年2月HRP催化的酶促反应第一步是特异性的（催化底物H2O2），其余反应无特异性，可以用不同的电子供体，因此最终产物的颜色也不同，如4-氯-1-萘酚（CN）呈蓝黑色、四甲基联苯胺（TMB）呈深蓝色、3-氨基-9-乙基卡巴唑（AEC）呈红色、3,3-二氨基联苯胺（DAB）呈棕色。AEC室温下稳定，但不能进行脱水等处理，时间长易褪色。DAB是目前广泛应用的电子供体之一，较为敏感，切片可以脱水透明处理，而且终产物具有嗜锇性，经四氧化锇处理后电子密度增加，适用于电镜下确定抗原的存在。但是，DAB可能具有致癌性，应尽量减少吸入和接触，最好将DAB制成10倍储存液，分装于-20℃保存，临用时稀释、过滤。CN较DAB敏感性略差，但其终产物较为局限，很少弥散，适于光镜观察第59页，课件共87页，创作于2023年2月第60页，课件共87页，创作于2023年2月（2）ALP标记显色：ALP标记抗体主要用于内源性过氧化物酶较高的红细胞、淋巴细胞等免疫组化显色。ALP以AS-Mx为底物，FB/FR为显色剂，生成蓝色/红色不溶性沉淀。显色液内加入终浓度为2~4mmol/L的左旋咪唑（levamisole），大多数内源性ALP活性可被抑制。通常左旋咪唑以每毫升60~120mmol/L浓度的储存液-20℃保存，应用时稀释30倍。为避免反复称取和试剂吸水，萘酚AS-Mx、FR和FB均应小量分装后-20℃保存。第61页，课件共87页，创作于2023年2月第62页，课件共87页，创作于2023年2月（二）非酶标记抗体染色法由于酶标抗体法中酶与抗体之间的共价键结合能损害部分抗体和酶的活性，抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织结合可导致背景染色等。1969年Masson建立了非酶标桥抗体法（bridgeantibodymethod），1970年Sternberger创建了辣根过氧化物酶-抗辣根过氧化物酶法（peroxidaseanti-peroxidasemethod，PAP）。第63页，课件共87页，创作于2023年2月1．桥抗体法首先制备高效价的特异性抗酶（HRP）抗体（三抗），然后利用二抗作为“桥梁”，将抗酶抗体连接在与组织待测抗原结合的一抗上，再将酶结合在抗酶抗体上，经显色后显示抗原的存在。具有二次放大作用，比间接法更为敏感，但操作步骤复杂。制备三抗和二抗的动物必须与一抗为同一种动物，以保证其相互结合。二抗的一个Fab片断与一抗的Fc段结合，另一个Fab片断与三抗的Fc段结合，二抗作为连接一抗和三抗的“桥梁”，故称为桥抗体。当三抗与二抗结合后，再加HRP，此时HRP即可与三抗自然结合，从而形成一个复杂的抗原-一抗-二抗-三抗-HRP复合物而显色第64页，课件共87页，创作于2023年2月酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）HRP二、酶桥法原理：HRP标记在抗酶抗体（三抗）上，抗原---特异性抗体---第二抗体---第三抗体●HRP复合物一抗、三抗有何关系？第65页，课件共87页，创作于2023年2月优点：与酶标记抗体法相比，敏感性高（酶与三抗通过抗原-抗体反应结合，避免直接标记引起两者活性降低）缺点：

较费时

步骤：四步法第66页，课件共87页，创作于2023年2月2．PAP法用PAP复合物作为酶标显色手段。PAP是一种可溶性酶-抗酶血清复合物，可作为特异性显色基团。PAP法简化了操作步骤，提高了灵敏度，是目前免疫组织化学染色常用的方法（图）。PAP法比间接荧光法灵敏，所用第一抗体的浓度可低于间接荧光法10倍，也可用其它酶代替HRP与相应的抗体组成复合物，如ALP-抗ALP等。原理：抗原---特异性抗体---第二抗体(桥抗体)---PAP复合物第67页，课件共87页，创作于2023年2月组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRPPAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法）原理：与酶桥法相似，不同之处是将酶与三抗制备成PAP复合物。抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗）---PAP复合物第68页，课件共87页，创作于2023年2月优点：敏感性较高背景染色较轻局限：特异性抗体与PAP必须为同一种属动物

步骤：三步法第69页，课件共87页，创作于2023年2月PAP复合物是HRP的抗体和HRP结合而生成的一种复合物。每个PAP复合物由2个抗HRP的IgG分子及3个HRP分子组成。PAP法也需用三抗。首先用特异的第一抗体（多为兔或小鼠IgG）孵育组织切片，其次用抗第一抗体（IgG）的抗体即二抗（如羊抗兔IgG或驴抗小鼠IgG）作为“桥梁”，然后用PAP复合物与二抗结合。二抗（桥抗）IgG分子有两个Fab段，一个与一抗结合，另一个与PAP复合物结合。最后，用HRP的底物来显示PAP复合物。有若干种底物可供选择，不同底物可以产生不同的颜色反应。第70页，课件共87页，创作于2023年2月三、结果判断在科研工作中，免疫组织化学染色结果可进行定性及定量分析。应熟悉所用的实验方法、抗体的优点和局限性，严格操作步骤，控制控制条件，避免主观意识，进行客观判断，认真地分析。需要强调的是，最好将对照组及实验组的切片贴在同一张载片上或将切片在相同的条件下同时孵育，尽可能保证处理条件一致，使结果具有可比性。第71页，课件共87页，创作于2023年2月（一）对照实验进行免疫组织化学染色时，必须证实组织内显示的有色产物确实是抗原与相应的特异性抗体结合所产生的。如前所述，影响免疫组织化学染色过程的因素很多，必须要有严格的对照才能对染色结果作出正确的评价。常用的实验对照有：

1．阳性对照用已知含靶抗原的组织切片（最好是冷冻切片）与待检标本同样处理，染色结果应为阳性，称阳性对照。通过阳性对照可证明靶抗原有活性，抗体特异性高，染色过程中各个步骤以及所使用的试剂合乎标准，染色方法可靠。第72页，课件共87页，创作于2023年2月尤其当待检标本为阴性时，阳性对照切片呈阳性反应可排除待检标本假阴性的可能。所以，若预期染色结果为阴性时，必须设阳性对照。若阳性对照亦不显色，说明抗原保存、染色方法和抗体效价等某一方面存在问题。目前，各试剂公司对不同的试剂盒都有阳性对照。

2．阴性对照用已知不存在相应靶抗原的组织标本染色，结果应为阴性。阴性对照可排除在染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的假阳性结果。当待测标本为阳性结果时，阴性对照更为重要。阴性对照包括以下几种：第73页，课件共87页，创作于2023年2月（1）空白对照：用缓冲液替代一抗是最常用的空白对照，染色结果应为阴性，说明染色方法可靠、一抗特异性强。实验中应常规设立空白对照。（2）替代对照：用制备第一抗体相同动物的免疫前血清或相同种属动物的正常血清替代第一抗体，染色结果应为阴性。这可证明待检组织切片的阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是该抗体与组织内靶抗原特异性反应的结果。第74页，课件共87页，创作于2023年2月（3）自身对照：用同一组织切片上与靶抗原无关的其它抗体的染色作对照，应为阴性。阳性与阴性结构同在一个视野中，相互印证，这本身就是对阳性反应的特异性对照。如无关抗体在相同部位出现类似的阳性结果，多为非特异性着色。（4）吸收试验：先将过量的已知抗原与对应的抗体混合孵育，两者形成特异性结合，再用结合后的混合物孵育切片，染色结果应为阴性。若染色结果仍为阳性，则为非特异性染色。此法可证明待检组织切片的阳性结果是该抗体与组织内靶抗原特异性反应的结果。但此法操作步骤繁琐，抗原和抗体的用量较大，价格昂贵。第75页，课件共87页，创作于2023年2月（二）非特异性染色非特异性染色的来源主要有以下几个方面：1．组织细胞内色素与DAB沉淀物颜色类似的色素，如黑质内的神经黑色素容易混淆，可用其他电子供体或免疫荧光技术鉴别，也可用ALP代替HRP进行染色。2．类过氧化物酶红细胞内的血红素辅基有类过氧化物酶活性，如组织内存在红细胞，即使不加过氧化物酶也可出现阳性着色。用甲醇-0.3%H2O2混合液孵育30min，或直接用3%H2O2溶液孵育30min，可以抑制这种假阳性着色。甲醇能使血红素中的亚铁血红素游离，后者被H2O2破坏，从而抑制类过氧化物酶的活性。

第76页，课件共87页，创作于2023年2月3．内源性过氧化物酶主要存在于粒细胞、巨噬细胞和固定效果较差的胶质细胞，能与DAB-H2O2反应出现假阳性。所以，富含此类细胞的脾、肝、骨髓等组织染色时最好先阻断内源性过氧化物酶，可用甲醇-H2O2封闭4．游离醛基醛类固定的组织切片可能存在游离醛基，后者能与蛋白质（IgG）非特异性结合导致假阳性。用白蛋白或封闭性阻断血清预先孵育切片，可将其抑制。5．疏水键和离子键免疫球蛋白可通过疏水键和离子键与组织中的碱性蛋白或Fc受体非特异性结合，用正常血清封闭非特异结合位点即可消除非特异性着色.第77页，课件共87页，创作于2023年2月6．天然抗体和不纯抗体天然抗体指因动物自然感染等因素血清中存在的部分抗体，不纯抗体是在制备抗体血清时所用的抗原不纯而获得的抗体含有杂质抗体，与组织成分结合可出现非特异性着色。除去的方法是尽可能高地稀释抗体，以减低非特异抗体的浓度。7．载体蛋白制备分子量小于4kD的小分子多肽抗体时，需要借助载体蛋白使小分子多肽获得免疫原性。但载体本身也具有抗原性，