蛋白质分离纯化

蛋白质分离纯化第1页，共43页，2023年，2月20日，星期四操作基本注意事项刻度吸管专管专用血清2ml一支PBS2ml一支(NH4)2SO42ml、0.5ml各一支实验前用蒸馏水清洗3次备用实验过程中：清水7次蒸馏水3次洗耳球不要被污染每次吸取液体液面不要过高视线要与观察刻度水平不要污染第2页，共43页，2023年，2月20日，星期四刻度吸管读数刻度吸管数据读取，视线要与液面保持平齐。第3页，共43页，2023年，2月20日，星期四蛋白质的分离纯化

IsolationandPurificationofProtein第4页，共43页，2023年，2月20日，星期四实验目的掌握盐析、凝胶层析分离纯化蛋白质的基本原理和操作步骤掌握离心机的操作熟悉蛋白质定性检测方法第5页，共43页，2023年，2月20日，星期四实验原理1盐析法23层析法离心技术4检测蛋白质、NH4+的方法第6页，共43页，2023年，2月20日，星期四盐析1[1]逐滴：边摇边缓慢滴入[2]混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动不完全流出式刻度吸管：有“红色彩环”，当液体流出后，再停留15秒并转动。清洗刻度吸管：自来水7次蒸馏水3次注意不要污染洗耳球。第7页，共43页，2023年，2月20日，星期四盐析法定义：盐析是指溶液中加入大量中性无机盐以破坏蛋白质的稳定因素，而使蛋白溶解度降低并使之从溶液中沉淀析出的现象。原理：

破坏蛋白质的稳定因素：水化膜、电荷层。中性盐：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl优点：蛋白质不变性1第8页，共43页，2023年，2月20日，星期四盐析法1影响因素：pH值：被分离的蛋白质在其等电点附近效果最好盐的饱和度：盐的饱和度不同析出的蛋白质也不相同100%(NH4)2SO4：主要清蛋白沉淀50%(NH4)2SO4：主要球蛋白都沉淀33%(NH4)2SO4：主要γ-球蛋白沉淀温度要求不太严格：对温度敏感的蛋白质在低温（4℃）一般可在室温进行操作。蛋白质浓度：浓度过高时，常常出现共沉现象浓度过稀时回收率太低。因此盐析蛋白质含量25-30g/L。蛋白质分子颗粒大小和亲水程度不同相对分子质量和所带电荷不同第9页，共43页，2023年，2月20日，星期四盐析1[1]逐滴：边摇边缓慢滴入[2]混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动[3]弃上清：直接倾倒（管口在滤纸上沾干净）[4]环壁：环绕离心管壁滴下清洗刻度吸管：自来水7次蒸馏水3次第10页，共43页，2023年，2月20日，星期四离心技术离心原理：利用离心力将悬浮液中的悬浮颗粒快速沉降，借以分离比重（密度）不同的各种物质成分的方法。3第11页，共43页，2023年，2月20日，星期四离心技术离心机分类

根据离心机的最大转速分类可以分为三类

<5000rpm低速离心机

5,000-25,000rpm高速离心机25,000-100,000rpm超速离心机3第12页，共43页，2023年，2月20日，星期四离心操作要领根据待离心的溶液性质和体积选择合适的离心管离心管连外套管一起平衡对称方向放入离心机中（转子对角线）当离心速度减为零时，方可打开离心机盖第13页，共43页，2023年，2月20日，星期四离心操作要领离心前一定要配平，配平后放入离心机转子对角线第14页，共43页，2023年，2月20日，星期四盐析1[1]逐滴：边摇边缓慢滴入[2]混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动[3]弃上清：直接倾倒干净（管口在滤纸上沾干净）[4]环壁：环绕离心管壁滴下清洗刻度吸管：自来水7次蒸馏水3次第15页，共43页，2023年，2月20日，星期四血液成分血浆（plasma）：将新鲜血液，经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体（上层淡黄色清液）。第16页，共43页，2023年，2月20日，星期四人血清中几种主要蛋白质组分*血清蛋白质等电点分子量占蛋白质总量%清蛋白4.6469,00057～72α1-球蛋白5.06200,0002～5α2-球蛋白5.06300,0004～9β-球蛋白5.1290,000～150,0006.5～12γ-球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20*醋酸纤维素膜电泳。γ-球蛋白是一类结构及功能相似的多种蛋白质。血清含量为0.7-1.5%。第17页，共43页，2023年，2月20日，星期四血清血清(serum）:

指血液凝固后，析出淡黄色透明液体。血清与血浆的区别：

血清中没有纤维蛋白原等凝血因子第18页，共43页，2023年，2月20日，星期四层析法层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使其在随流动相流经固定相时，在固定相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。脱盐常用透析法和凝胶过滤层析法。2第19页，共43页，2023年，2月20日，星期四透析法透析法的优点是透析后样品终体积较小、简便，但所需时间较长；透析法的缺点是最好低温进行，且盐不易除尽。第20页，共43页，2023年，2月20日，星期四凝胶层析法凝胶过滤法优点是整个处理过程非常“温和”，保护样品(如蛋白质、酶等)的生物活性，则是能将盐除尽，所需时间也明显缩短，但其凝胶过滤后样品终体积较大。第21页，共43页，2023年，2月20日，星期四凝胶层析法分子较大的物质先流出如γ-球蛋白，不可进入凝胶颗粒内部，只沿凝胶颗粒外的间隙随流动相向下流动，受到的阻滞作用小，流程短，移动速度快，先流出。分子较小的物质后流出如(NH4)2SO4，可扩散渗透进入凝胶颗粒（网孔）内部，流程长，移动速度慢，后流出。第22页，共43页，2023年，2月20日，星期四层析类型：凝胶过滤层析法（gelfiltrationchromatography）固定相凝胶对不同组分因分子大小不同而受阻滞程度不同。离子交换层析法（ionexchangechromatography）各组分带电性质不同与固定相离子交换剂作用力不同。亲和层析法（affinitychromatography）固定相只能与一种待分离组分（生物高分子如抗原-抗体、酶-底物）间的生物特异性吸附专一可逆地结合。第23页，共43页，2023年，2月20日，星期四检测蛋白质、NH4+的方法检测蛋白质磺基水杨酸：白色絮状沉淀-有蛋白质出现检测NH4+

奈氏试剂：棕黄色沉淀-含有NH4+

4第24页，共43页，2023年，2月20日，星期四实验步骤1盐析23层析检测第25页，共43页，2023年，2月20日，星期四盐析1[5]洗涤：轻轻沿管壁滴入，倾斜并旋转离心管[6]溶解沉淀：振摇第26页，共43页，2023年，2月20日，星期四上午任务

顺利结束！下午1:00正式开始第27页，共43页，2023年，2月20日，星期四层析装柱上样加洗脱剂收集2装柱1上样2加洗脱剂3收集4第28页，共43页，2023年，2月20日，星期四凝胶层析法层析PBS（滴瓶）葡聚糖凝胶G-25（配1支胶头吸管）小试管1个（装蒸馏水）层析柱1个（20×1.5cm）*大试管(20个)黑色比色盘、白色比色盘（各1个）试剂：*自来水洗后，蒸馏水少量冲一下，活塞关上。加蒸馏水检查是否漏水,然后倒挂在铁架上，活塞打开控干。

仪器：第29页，共43页，2023年，2月20日，星期四凝胶层析法基本操作1、装柱:2、平衡:3、上样：4、收集：5、检查：6、合并样品：第30页，共43页，2023年，2月20日，星期四1、装柱:层析柱垂直固定支架上环壁加蒸馏水少许，打开活塞约1滴/秒，关上.再环壁加入PBS约10ml，打开活塞，剩下约1cm后，关闭。SephadexG-25凝胶用吸管吹吸呈混悬液，再边混匀边用吸管环壁加入，快速连续，加到柱顶部。打开出口，继续补加，流速约1滴/3秒钟,自然沉降。当柱床高约15cm时，床面上留一层液体，约1cm高，关闭活塞，备用。第31页，共43页，2023年，2月20日，星期四2、平衡:完全打开下夹，以1-3倍柱体积的PBS加满柱上层约＞15cmPBS流过凝胶柱，然后夹住下口。凝胶过滤PBS不与盐析PBS混用。每次柱表面始终要保持着一层溶液（1-3cm），止凝胶柱进入空气。注意事项：第32页，共43页，2023年，2月20日，星期四3、上样打开下夹，等液面刚好接近凝胶表面，约1~2mm时，关上活塞；用乳头吸管吸出γ-球蛋白溶解液，在凝胶表面上2~3cm高，沿柱内壁小心缓慢，环绕排出样品，并逐渐提高吸管加入，尽量不使床面扰动；拧开活塞，控制流速约（1滴/3秒），待蛋白质液流入凝胶，但柱表面仍残留1~2mm液体层时，立即如上法加入PBS约1ml冲洗样品收集样品的同时继续不断环壁加入PBS进行洗脱，胶面上端始终保留约1-2cm高的洗脱液，注意保持胶面平整。第33页，共43页，2023年，2月20日，星期四4、洗脱收集：干净小试管20支，依次摆在试管架上，并编号。开始收集后每管10滴，依次收集。第34页，共43页，2023年，2月20日，星期四5、检查及凝胶再生：在检测时，用乳头滴管吸取试管中溶液后，应马上及时洗净，洗至少3次，再吸取下一管，以免造成相互污染。依次从每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入1滴20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋白质出现，实验记录+；继续依次检测，直到检查不出有白色沉淀为止，实验记录-；经上述检查含有蛋白质的最后一管开始，各取1滴溶液，放置在白色比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂，若呈现棕黄色沉淀说明含有NH4+，实验记录+再洗柱依次检测直至无NH4+即用奈氏试剂检测无棕黄色沉淀为止，实验记录-，柱再生完毕。第35页，共43页，2023年，2月20日，星期四样品收集磺基水杨酸-白色絮状沉淀-有蛋白质出现奈氏试剂-棕黄色沉淀-含有NH4+

第36页，共43页，2023年，2月20日，星期四凝胶回收检测直至无NH4+为止，柱再生完毕，凝胶倒回到原来的锥形瓶回收，留待再用。立刻洗净层析柱。第37页，共43页，2023年，2月20日，星期四6、合并样品：将含蛋白最高且无NH4+的几管蛋白，用滴管合并在一个EP管中,此即为已脱盐后的γ—球蛋白溶液。将此EP管，冷冻保存在-20℃或-70℃冰箱。作好标记：班级，姓名，样品名，日期。第38页，共43页，2023年，2月20日，星期四QQ:954570564TELhankYou!第39页，共43页，2023年，2月20日，星期四蛋白质的沉淀由于蛋白质溶液是亲水溶胶，存在着两个稳定因素：电荷和水化膜。蛋白质胶粒上的同性电荷互相排斥，不易凝聚成团下沉；蛋白质表面的许多亲水基团的水合作用形成一层水化膜，在胶粒之间起了隔离作用。因此，蛋白质在水溶液中，虽分子量很大，但仍能维持稳定的溶解状态。第40页，共43页，2023年，2月20日，星期四蛋白质的沉淀一方面盐离子同水结合，降低溶液中自由水的浓度，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水化膜，蛋白质溶解度降低。另一方面加入的盐离子部分中和了蛋白质分子相互排斥的电荷，破坏蛋白质亲水胶体的稳定因素，蛋白质相互聚集沉淀当盐浓度增加到一定浓度时：第41页，共43页，2023年，2