第十一章 细菌

第十一章细菌第1页，共47页，2023年，2月20日，星期三细菌的分类试验台操作操作规则获得细菌的途径细菌培养和维护获得分离的克隆细菌计数贮藏污染第2页，共47页，2023年，2月20日，星期三一细菌的分类

1级（不致病）大肠杆菌枯草杆菌2级（低致病）沙门氏菌志贺氏菌BL1&BL2级操作3级（高治病）结核分支杆菌牛分支杆菌BL3级操作4级（对个体和社会造成巨大危害）部分节肢动物传染病毒、沙粒病毒和线状病毒

BL4级操作第3页，共47页，2023年，2月20日，星期三细菌的分类试验台操作操作规则获得细菌的途径细菌培养和维护获得分离的克隆细菌计数贮藏污染第4页，共47页，2023年，2月20日，星期三二试验台操作筛选突变体培养有机体测定细菌的浓度离心培养物转化抽提质粒培养使用过的废物分：锋利的、液体废物、固体废物、放射性废物等第5页，共47页，2023年，2月20日，星期三细菌的分类试验台操作操作规则获得细菌的途径细菌培养和维护获得分离的克隆细菌计数贮藏污染第6页，共47页，2023年，2月20日，星期三三操作规则遵守最通常的实验室安全守则每天最少清洗一次试验台丢弃可能传染疾病的废物前要清除污染接触可传染的物质后，在离开实验室前都要洗手实验中尽量避免产生气溶胶不要积累培养皿和试管第7页，共47页，2023年，2月20日，星期三废物处理液体废物：加入次氯酸钠至终浓度10%，放置30分钟后再倒入下水道，大量水冲洗。固体废物：当作有生物危害的物品处理，高温高压灭菌后丢弃，这是一个实验室或是系的责任而且必须注明。第8页，共47页，2023年，2月20日，星期三细菌的分类试验台操作操作规则获得细菌的途径细菌培养和维护获得分离的克隆细菌计数贮藏污染第9页，共47页，2023年，2月20日，星期三四获得细菌的途径实验室成员其他研究人员美国模式培养物保藏所（ATCC）其他的收集和服务组织(疾病控制和防治中心等)每得到新菌株都要确认它的确是你所需要的那种，不要根据包装或价格来认定第10页，共47页，2023年，2月20日，星期三培养细菌的价值细菌的分类试验台操作操作规则获得细菌的途径细菌培养和维护获得分离的克隆细菌计数贮藏污染第11页，共47页，2023年，2月20日，星期三五细菌培养和维护摇瓶培养和固定培养液体培养、半固体培养和固体培养2细菌培养的方法1了解所培养微生物的生理知识第12页，共47页，2023年，2月20日，星期三

大肠杆菌在液体培养基中的正常生长曲线滞后期稳定期对数期死亡期第13页，共47页，2023年，2月20日，星期三3培养基的分类

按用途分类基础培养基完全培养基鉴别培养基选择培养基厌氧培养基按物理性状分类液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。半固体培养基：含0.3％～0.5％琼脂。用于观察细菌动力、保存菌种。固体培养基：平板、斜面。含2％～2.5％琼脂。平板：用于细菌的分离培养。斜面：用于纯培养、保存菌种。第14页，共47页，2023年，2月20日，星期三4培养基制备的一般程序调配溶化矫正pH过滤澄清分装灭菌检定保存第15页，共47页，2023年，2月20日，星期三4培养基制备的一般程序调配：按照培养基配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。另用量筒量取所需蒸馏水量。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。调pH值：用1NNaOH或1NHCl调至培养基规定的pH值，用pH试纸对照。分装加塞：注意不要污染棉塞。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。灭菌：不同培养基采取不同灭菌方法。检定：培养基灭菌后必须在37℃下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。保存：一般至4℃保存备用。

第16页，共47页，2023年，2月20日，星期三复苏培养复苏冻干菌复苏冻存菌株复苏复杂营养细菌培养物第17页，共47页，2023年，2月20日，星期三复苏冻干菌的步骤

用70%的乙醇清洁管子的外部加入0.4ml的无菌培养基（预热的）至试管中用吸管小心吹打，直到菌体完全悬浮将悬浮液加到含5ml培养基（预热的）的试管中，留下10ul将剩下的10ul菌液划线培养在合适条件下培养试管、平板或斜面第18页，共47页，2023年，2月20日，星期三复苏培养复苏冻干菌复苏冻存菌株复苏复杂营养细菌培养物第19页，共47页，2023年，2月20日，星期三复苏冻存菌株的步骤

将冻存管拿出后立即放到实验台或通风橱火焰灼烧接种环，冷却几秒后，接触冻存培养基的顶部把培养物放回冰上在平板或斜面上划线冻存管立即放回冰箱，至少-70度在适当的条件下培养平板或斜面第20页，共47页，2023年，2月20日，星期三复苏培养复苏冻干菌复苏冻存菌株复苏复杂营养细菌培养物第21页，共47页，2023年，2月20日，星期三复苏复杂营养细菌培养物的步骤

将冻存管拿出37摄氏度溶解菌体使用巴氏管转移约1/2体积菌液至4ml新鲜培养基中，把剩下的菌液放到冰上适当条件下培养冻存管立即放回冰箱，至少-70度第22页，共47页，2023年，2月20日，星期三培养细菌的价值细菌的分类试验台操作操作规则获得细菌的途径细菌培养和维护获得分离的克隆细菌计数贮藏污染第23页，共47页，2023年，2月20日，星期三获得分离的克隆平板划线在平板底面上标好你的名字、日期和菌株。加热接种环。左手拿试管，振荡悬浮菌体，用右手的最后两个手指打开试管盖子，将试管口在火焰上烧一下。插入接种环（已经冷却），不要接触试管壁，插入液体表面即可。再一次将试管口在火焰上烧一下，盖好盖子放回试管架。动作要快，但是不要舞动接种环。左手拿平板，用最后的三个指头托住底面，用大拇指和食指微微掀起盖子。第24页，共47页，2023年，2月20日，星期三7.在第一区靠近边缘的地方把接种环接触到培养基表面，不

要把接种环插到培养基里面。在这一区内有节奏地前后移动接种环，直到运动到中央，不要跨线。8.盖好平板的盖子，从前到后再次灼烧接种环5-10s。9.90°旋转平板，打开盖子，接触到第一区中间线末端处。从上一条线处划过并进入空区，再在这一区内继续划线，注意不要过线。10.在空白区域内重复步骤8、9操作两次。11.再次灼烧接种环，把它放好。12.在适当温度下，倒置培养。第25页，共47页，2023年，2月20日，星期三第26页，共47页，2023年，2月20日，星期三第27页，共47页，2023年，2月20日，星期三在一块平板上划线培养多个样品斜面和穿刺培养使用接种针、牙签或Tip挑取克隆。第28页，共47页，2023年，2月20日，星期三第29页，共47页，2023年，2月20日，星期三培养细菌的价值细菌的分类试验台操作操作规则获得细菌的途径细菌培养和维护获得分离的克隆细菌计数贮藏污染第30页，共47页，2023年，2月20日，星期三细菌计数使用PetroffHausser计数计活菌平板计数第31页，共47页，2023年，2月20日，星期三使用PetroffHausser计数计用1ml或2ml的移液管无菌移取0.5ml的菌液至微量离心管中，如果菌液量较少，就减少移取的体积。取出计数计，用水和70%的乙醇将其清洗干净，用吸水纸吸干，将盖玻片放上，保证计数室处在盖玻片的中央。将50µl菌液加入计数室。取样前将菌体摇匀，吸出50µl，不要直接打下。缓慢按下移液器的按钮，使液体滴出，但不要滴下，让这一滴液体留在嘴尖，把这一滴液体接触盖玻片。第32页，共47页，2023年，2月20日，星期三

的一边，由于毛细现象液体会被吸入。注意不要使液体溢出计数室，如果液体溢出到沟槽内，那么把板吸干重新来过。静置5min。把计数板放在载物台上，用10×物镜找到计数室后，换到40×物镜。大体数一下以决定是否需要稀释，在25个小方块内应有100-500个菌体。如果太多，计数会不准确。稀释5或10倍后，半数时会省下很多时间。第33页，共47页，2023年，2月20日，星期三计数。最少要计数25个方格内的菌体数（包括压线的），将数出的总数除以方格数，重复3次取平均值。计算。将平均每格内的细胞数乘以2×107，如果进行稀释了，再乘上稀释倍数，得到的是原始菌液的细胞数/ml。第34页，共47页，2023年，2月20日，星期三第35页，共47页，2023年，2月20日，星期三第36页，共47页，2023年，2月20日，星期三活菌平板计数制作稀释液准备好稀释用的试管，最常用的是10倍稀释。900µl的培养基逐个进行稀释、混合和移液。如果不清楚细菌生长的特点可以多准备8-10个平板。取100µl菌液至1号稀释管中（10-1稀释），弃掉移液管，将试管贴在振荡器上混匀。从1号管中取100µl液体至2号稀释管（10-2稀释）弃掉移液管，把试管贴在振荡器上混匀。依次转移100µl至一系列的稀释管中。第37页，共47页，2023年，2月20日，星期三涂布平板在平板上标明稀释度、姓名、日期和样品名，最好能再做一个相同的备用板。从最后稀释度的试管中取出100µl，慢慢滴入对应的平板内，弃掉移液管。将平板放到旋转台或实验台上。将涂布棒在酒精内浸一下，酒精必须覆盖头部和把手底部的1英寸处。第38页，共47页，2023年，2月20日，星期三将涂布棒在火上灼烧，火焰应该把涂布棒的前端全部烧遍，但是要反棒上的火焰立刻弄灭。将涂布棒放在培养基上直到冷却，注意不要接触到菌液。前后刮动涂布棒，争取把液体覆盖到整个平板上。如果有旋转台，把涂布棒固定，旋转台面进行涂布。待平板静置5分钟后再倒置放入培养箱，当菌落都能看清时，立即从培养箱中取出，不要让菌落生长得过大。第39页，共47页，2023年，2月20日，星期三计数菌落数和计算集落形成单位检查所有的平板，挑出一个菌落数最接近30-300以内的平板，只数一块板，如果你做了备用板，那么就数两块。数出菌落数。菌落数乘以稀释度倍数就得到原始菌液的浓度。第40页，共47页，2023年，2月20日，星期三培养细菌的价值细菌的分类试验台操作操作规则获得细菌的途径细菌培养和维护获得分离的克隆细菌计数贮藏污染第41页，共47页，2023年，2月20日，星期三贮藏短期贮藏

4℃几个星期，尤其平板。封口膜长期贮藏传代培养（不推荐）优点：能够快速得到菌体，便宜缺点：活力降低，污染的可能性增加，表型的稳定性下降。2.干燥常用于真菌和某些细菌，可保存数年优点：便宜，不可能被污染。缺点：关于使用这种方法的菌株资料很难得到。第42页，共47页，2023年，2月20日，星期三3.冻干可保存10年甚至50年。优点：很容易做到长期保存。缺点：不是所有的实验室都拥有相关的设备，而且对于经常使

用的菌株也不方便，还有些菌株会丧失大量活力。4.低温冰箱中冷冻和保存优点：绝大多数细胞能够很好地保存，是推荐使用的长期保存方法。缺点：冰箱价格昂贵，维护费也很高，冻融的时候会对细胞产生伤害。第43页，共47页，2023年，2月20日，星期三培养细菌的价值细菌的分类试验台操作操作规则获得细菌的途径细菌培养和维护获得分离的克隆细菌计数贮藏污染第44页，共47页，2023年，2月20日，星期三污染平板每次使用平板前