第三章色谱分离原理

第三章色谱分离原理第1页，共106页，2023年，2月20日，星期三1906年，俄国植物学家Tswett(次维特）分离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱法（chromatography）。

第2页，共106页，2023年，2月20日，星期三柱色谱示意图（columnchromatography)固定相？流动相？Stationaryphase?Mobilephase?第3页，共106页，2023年，2月20日，星期三现代色谱法（chromatography)的发展1931年，德国的Kuhn和Lederer重复了Tswett的实验，得到很好的结果，色谱法因此得到很大的推广。1940年，Martin和Synge提出了液-液分配色谱法，又把塔板的概念引入色谱法中，初步建立了塔板理论。1941年，他们提出了用气体代替液体做流动相的可能性，得了1952年的诺贝尔化学奖。第4页，共106页，2023年，2月20日，星期三20世纪初被发现，30年代在实验室成为常规方法；20世纪40年代在实验室得到快速发展；20世纪50年代建立气-液色谱法，是现代色谱法发展的里程碑，催生了许多现代的色谱方法色谱法（chromatography)的发展第5页，共106页，2023年，2月20日，星期三A.J.P.MARTIN和R.L.M.Synge

A.J.P.MARTIN.

(1910-2002)oftheBritishNationalInstituteforMedicalResearchsharedwithfellowcountrymanR.L.MSyngetheNobelPrizeinChemistry(1952)fortheinventionofpartitionchromatography.R.L.M.Synge

bornOct.28,1914,Liverpool,Eng.diedAug.18,1994,Norwich,Norfolk.

SyngestudiedatWinchesterCollege,Cambridge,andreceivedhisPh.D.atTrinityCollegetherein1941.第6页，共106页，2023年，2月20日，星期三2.色谱法的发展历史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1944Consden等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956VanDeemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957

基于Moore和Stein的工作，离子交换色谱的氨基酸分析专用仪问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。第7页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代获奖学科获奖研究工作1937化学类胡萝卜素化学，维生素A和B1938化学类胡萝卜素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究1970化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究1972生理学、医学抗体结构的研究第8页，共106页，2023年，2月20日，星期三

第9页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.1.2色谱法的定义

色谱法是一种分离方法，它利用物质在两相中分配系数的微小差异进行分离。当两相做相对移动时，使被测物质在两相之间进行多次分配，这样原来的微小差异产生了很大的效果，使各组分分离，以达到分离分析及测定一些物理化学常数的目的。第10页，共106页，2023年，2月20日，星期三有两相，流动相和固定相——气相色谱固定相就是色谱柱里边装的填料，流动相就是气体或者称为载气(carriergas)。流动相对固定相做连续相对运动，流动相浸透通过固定相；被分离的各样品分子（溶质、组分）存在差异，即与流动相和固定相具有不同的作用力。色谱分离的共性第11页，共106页，2023年，2月20日，星期三色谱法（chromatography)意义

色谱法又称色层法或层析法，是一种物理化学分离分析方法；比任何单一分离技术都有效和普遍，它的出现使分离技术上升为“分离科学”；分离效率高，可使性质非常相似很难或不能用萃取、蒸馏进行分离的混合物得到分离；目前既是一种分离技术，也是一种分析技术，可同时实现分离和分析；是现代分离科学和分析化学中发展最快，应用最广、潜力最大的领域之一。第12页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.1.3色谱法的分类根据流动相状态进行一级分类，如气相色谱、液相色谱，然后再根据流动相种类、或固定相种类等进一步分类，如根据流动相种类，流动相为超临界流体（SupercriticalFluidChromatography），称为超临界流体色谱根据分离原理分类，如吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、络合色谱、亲和色谱第13页，共106页，2023年，2月20日，星期三按固定相的外形分类

固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。

根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表。第14页，共106页，2023年，2月20日，星期三第15页，共106页，2023年，2月20日，星期三第16页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.1.4色谱流出曲线及有关术语

一．流出曲线和色谱峰

高斯曲线，对称峰第17页，共106页，2023年，2月20日，星期三二、基线

是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，稳定的基线应该是一条水平直线.三、峰高

色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图18－3中B′A第18页，共106页，2023年，2月20日，星期三四、保留值（1）死时间tM

不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图18－3中O′A′。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近．测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与tM的比值计算。第19页，共106页，2023年，2月20日，星期三

试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图18－3O′B．它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间．

（2）保留时间tR第20页，共106页，2023年，2月20日，星期三（3）保留体积VR

指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间t。的关系如下：

VR=tR·F0

（4）调整保留体积VR′

某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即

VR′=VR-VM第21页，共106页，2023年，2月20日，星期三

（5）相对保留值γ2.1

某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保留值：

由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据．必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比.第22页，共106页，2023年，2月20日，星期三六、容量因子k（Capacityfactor)容量因子是相对概念，可消除柱长等因素的影响。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数第23页，共106页，2023年，2月20日，星期三七、选择因子（分离因子）

可用符号α表示。在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的α作为重要参数．

式中tR2′为后出峰的调整保留时间，所以这时α总是大于1的。第24页，共106页，2023年，2月20日，星期三

色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：

（1）标准偏差σ

即0．607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图18－3中EF距离的一半。（2）半峰宽W1/2

即峰高一半处对应的峰宽，如图18－3中GH间的距离．它与标准偏差σ的关系是：

W1/2=2.354σ八、区域宽度第25页，共106页，2023年，2月20日，星期三

即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图中IJ的距离．它与标准偏差的关系是：

W=4σ

（3）基线宽度W第26页，共106页，2023年，2月20日，星期三第27页，共106页，2023年，2月20日，星期三（4）分离度（resolution)定量描述相邻两组分在色谱柱内的分离情况的指标。tR2,tR1组分的保留时间，W1，W2色谱峰底宽，R=1两峰基本分离，此时∆t=4σ;R=1.5两峰完全分离。第28页，共106页，2023年，2月20日，星期三

从色谱流出曲线上，得到信息是：

（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的最少个数．（2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析．(3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析．（4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据．（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据．第29页，共106页，2023年，2月20日，星期三

3.2色谱法分析的基本原理

色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。第30页，共106页，2023年，2月20日，星期三一、分配系数K和分配比k

1．分配系数K色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，如吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附/脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数为分配系数。它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即第31页，共106页，2023年，2月20日，星期三2.分配比k

(与溶剂萃取一章区分）

分配比又称分配容量或容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即第32页，共106页，2023年，2月20日，星期三

k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。

式中CS，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。第33页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.分配系数K与分配比k的关系

其中β称为相比率，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其β值一般为6～35；对毛细管柱，其β值为60～600。

第34页，共106页，2023年，2月20日，星期三分配系数K及分配比k与选择因子α的关系

根据对以上公式处理，对A、B两组分的选择因子，可用下式表示：

第35页，共106页，2023年，2月20日，星期三

上式表明：通过选择因子α把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，α对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则α=1，两个组分的分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。第36页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.3样品分子色谱运行的基本特点混合物中不同样品分子迁移速度不同（差速迁移）；（differentialmigration)同种组分分子在迁移过程中的分布离散(spreading);第37页，共106页，2023年，2月20日，星期三不同样品分子迁移速度差异

由于组分与两相之间的作用力存在差别，使得各组分在两相中的分配系数不同，分配系数越大的组分迁移速度越慢。色谱柱柱温、流动相、固定相的性质影响平衡分配系数，从而影响各组分的分离。第38页，共106页，2023年，2月20日，星期三分布离散(spreading)

在色谱柱入口处，相同组分分子存在一个狭窄的区域（区带）内；在迁移过程中，由于流体分子运动速度的差异，相同组分分子迁移速度出现差异，分布区带不断展宽。第39页，共106页，2023年，2月20日，星期三开管柱和填充柱中压力驱动和电渗驱动下的流动相输运第40页，共106页，2023年，2月20日，星期三柱色谱中溶质的区带迁移方法（1）洗脱法：流动相和固定相通常处于平衡状态，样品一次性加在色谱柱一端，流动相连续通过色谱固定相将样品组分一次洗脱出色谱柱；最方便的、常用的色谱方法，分析型色谱均采用此类型；（两相之间的分配不同）第41页，共106页，2023年，2月20日，星期三（2）置换法：

样品一次性加到柱上，采用置换剂作为流动相连续流经色谱柱，依次将组分置换下来。（置换剂与固定相之间的亲和力比任何组分都强，亲和力弱的先流出，亲和力强的后流出）

制备色谱和工业流程色谱，达到高通量制备纯化的目的（无需浓缩去除溶剂），纯物质的收集可控制在各置换区带的中心区域。第42页，共106页，2023年，2月20日，星期三（3）前沿法样品作为流动相或流动相的组成部分连续流经色谱柱，与固定相亲和力弱的样品组分，首先以纯化合物的形式流出，其次是亲和力较强的第二个组分与第一个组分的混合物，再次是第二个组分，以此类推。前沿法常用于某一组分或混合组分的吸附等温线，以及从主成分中分离出作用较弱的微量组分，是固相萃取技术的基础，很少用于制备分离。（色谱柱全部被样品污染）第43页，共106页，2023年，2月20日，星期三第44页，共106页，2023年，2月20日，星期三

最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标。3.4塔板理论（platetheory）第45页，共106页，2023年，2月20日，星期三该理论假定：

（i）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。（ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。（iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。（iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。为简单起见，设色谱由5块塔板（n＝5，n为柱子的塔板数）组成，并以r表示塔板编号，r=1，2…，n－l；某组分的分配比k=1.第46页，共106页，2023年，2月20日，星期三

根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1μg）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。当一个板体积（lΔV）的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0.5，其中气液（或气固）两相各为0.25而1号板上所含总量同样为0.5．气液（或气固）相亦各为0.25。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。第47页，共106页，2023年，2月20日，星期三

第48页，共106页，2023年，2月20日，星期三第49页，共106页，2023年，2月20日，星期三

按上述分配过程，对于n=5，k=1，m=1的体系，随着脉动进入柱中板体积载气的增加，由塔板理论可建流出曲线方程：

m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数。当流动相体积V=Vr时，C值最大，即第50页，共106页，2023年，2月20日，星期三

色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：理论塔板数与色谱参数之间的关系为：第51页，共106页，2023年，2月20日，星期三

从上两式可以看出，色谱峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。通常填充色谱柱的n＞103，H＜1mm。而毛细管柱n=105--106，H＜0.5mm由于死时间tM包括在tR中,而实际的tM不参与柱内分配,因而虽然计算的n值很大,H很小,但与实际柱效能相差甚远。所以,提出把tM扣除,采用有效理论塔板数neff和有效塔板高Heff评价柱效能。

第52页，共106页，2023年，2月20日，星期三

塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。第53页，共106页，2023年，2月20日，星期三塔板理论的特点和不足

(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。

(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。

(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。

(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。第54页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.6速率理论（1）涡流扩散：

在填充柱色谱中，粒径填料之间的间隙是流动相流动的通路。由于填料粒径、形状及填充柱床的不均一性都会使填充柱形成宽窄、长短不同的路径.流动相因不同路径的流速差异而引起的溶质分布区带扩展，称为涡流扩散（eddydiffusion)效应或称多路径效应(multiplepaths)Hm。

第55页，共106页，2023年，2月20日，星期三

λ表征粒子填充不均匀的常数项，称为填充不均匀因子，通常接近于1，它与粒径分布有关，粒径分布越窄，分布越均匀，λ值越小；dp为填料粒径。第56页，共106页，2023年，2月20日，星期三(2)纵向扩散（HL)

当一定浓度的溶质进入色谱柱后，溶质便会因为浓度梯度而向周围的流动相内扩散，如果进样口处的谱带是柱塞形的，扩散的结果是向流动相的运动方向扩散，即纵向扩散，造成谱带展宽，这种扩散称为纵向扩散（longitudinaldiffusion).纵向扩散是由分子的无规则运动引起，又称为分子扩散。第57页，共106页，2023年，2月20日，星期三纵向扩散(HL)=溶质在流动相中纵向扩散HL(m)+溶质在固定相中的纵向扩散HL(s)Dm,Ds——溶质在流动相和固定相中的扩散系数;μ—流动相的线速度；γ—扩散阻碍因子或填料因子，因填料不均匀性对扩散影响而引入的校正值，对于填充柱通常γ<1；对于开管毛细管柱，不存在路径弯曲，因而无扩散阻碍，γ=1。第58页，共106页，2023年，2月20日，星期三影响纵向扩散的因素HL与扩散系数成正比，与流速的线速度成反比；通常溶质在气相中扩散系数远大于在液相中的扩散系数，Dm≈104~105,HL对于气相色谱纵向扩散非常重要，对于高效液相色谱只要流速较高，纵向扩散HL对总理论塔板高度的贡献<1%。选择细颗粒且粒径分布均匀的填料，良好的填充，将有利于降低γ值。第59页，共106页，2023年，2月20日，星期三（3）传质阻力随着流动相在色谱柱中的迁移，溶质在流动相和固定相之间不断进行传质过程。由于溶质分子与固定相、流动相分子间相互作用，阻碍溶质分子快速传递实现分布平衡。这些导致传质速率限制的作用力称为传质阻力。传质阻力使得溶质在流动相和固定相之间的分配平衡不能瞬间建立，从而出现有些分子随着流动相移动超前，有些分子还未从固定相中解析出来移动滞后。第60页，共106页，2023年，2月20日，星期三流动相的传质阻力流动相的流速、流型及溶质在流动相中的扩散速度对溶质的谱带展宽有影响；管状色谱柱中，靠近管壁的附加阻力使流速减慢，位于管中心的流速最大，形成抛物面型速度梯度，这种速度梯度会造成谱带展宽；对于多孔固定相，一部分流动相要进入固定相的孔中，形成“停滞流动相”，从而造成谱带展宽；第61页，共106页，2023年，2月20日，星期三流动相传质阻力造成的谱带展宽式中，f1常数；k溶质的容量因子；dp固定相或填料的直径；Dm溶质在流动相中的扩散系数；μ流动相的线速度。思考：减小流速，减小粒径有利于减小这种传质阻力；增大扩散系数提高径向扩散，可抵消因柱截面的不同位置，溶质分子速度不同导致的不一致性。第62页，共106页，2023年，2月20日，星期三固定相传质阻力造成的谱带展宽溶质分子必须越过固定相与流动相之间的界面，才能进入或离开固定相，在固定相中停留的时间和路径的长短会影响谱带展宽的程度，式中，f2常数；k溶质的容量因子；df固定相或固定液膜的厚度；DS溶质在固定相中的扩散系数；μ流动相的线速度。思考：减小流速、减小粒径、增大扩散系数有利于减小这种传质阻力；固定相或固定液层越厚，色谱展宽越大，不利于传质和获得更高的分离效率。第63页，共106页，2023年，2月20日，星期三（4）完整的影响谱带展宽的表达式VanDeemter于1956年提出了填充气相色谱柱内总理论塔板高度的方程，即：此方程中，流动相的传质阻力被忽略不计。但在液相色谱中必须考虑。第64页，共106页，2023年，2月20日，星期三VanDeemter方程H-μ曲线双曲线函数，有极值，即有一个最佳流速，此时可获得最高柱效（最小理论塔板高度）。上述公式不随溶质、流动相以及固定相而改变，具有一定的通用性。依此公式可方便地计算出不同粒径填料的色谱柱在最佳条件下所能得到的最小理论塔板高度。第65页，共106页，2023年，2月20日，星期三VanDeemter范姆特方程H-μ曲线第66页，共106页，2023年，2月20日，星期三Paurnel于1961年对VanDeemter表达式进行修正，得出液相色谱中公式为：第67页，共106页，2023年，2月20日，星期三简式表达为：A—涡流扩散；B—纵向扩散；C----传质阻力；上式可较为精确地预测给定色谱柱在优化流动相流速下的柱效，以及各因素对总理论塔板高度的影响。第68页，共106页，2023年，2月20日，星期三Giddings修正考虑到流动相线速度对涡流扩散的影响及同时引起的流动相传质阻力，对方程进行修正：E为展宽系数，当μ

>>E时，即为VanDeemter方程；当E>>μ，E/μ→∞时，A/(1+E/μ)→0,因流速的急速降低，多路径的影响可忽略不计了。第69页，共106页，2023年，2月20日，星期三思考:液相色谱可通过使用细粒径颗粒、高柱压操作、低粘度流动相(提高柱温、加入CO2)达到最好的分离效果。液相色谱溶质在流动相中的扩散慢（扩散系数小），可通过采用比常规气相色谱低得多的流速来弥补比气相色谱低的柱效。非多孔填料最大限度地减小了因填料颗粒内传质慢而引起的柱效降低，但因表面积减小，溶质分子的保留值减小，不利于优化小分子的分离，但对大分子影响较小（大分子比小分子扩散系数小低1-2个数量级）。第70页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.4折合参数采用折合参数（h,ν,ϕ)代替绝对参数以比较不同类型色谱柱的柱效，如在不同颗粒填料、不同黏度流动相、不同扩散系数溶质的相互间比较。h——折合塔板高度；ν——折合流动相流速；Φ——柱流动阻抗因子。第71页，共106页，2023年，2月20日，星期三dp固定相颗粒的直径，Wh半峰宽；tR溶质的保留时间，h板间所含颗粒数，与颗粒大小无关.Dm溶质在流动相中的扩散系数；tR死时间。ν表示流动相以粒间扩散速度为单位的流速；∆p柱压降；柱的比透过度，ϕ用于表示不同粒度填充柱的渗透性和填装的密度，多孔填料ϕ在250~650之间，假如数值很高（正常值的10倍）说明色谱系统部分受阻，所以ϕ越小越好。第72页，共106页，2023年，2月20日，星期三折合板高与折合流速的关系为：此为折合板高方程，用于比较不同粒度填料的柱效能。B/v表示纵向扩散产生的折合板高；Av1/3,表示由偶合涡流引起的折合板高；Cv表示由流动相和固定相之间的慢传质引起的折合板高;A,B,C为常数，与柱的填充好坏有关，与粒径大小无关。第73页，共106页，2023年，2月20日，星期三求出ｈ求出νｈ对ｖ作图，求出Ａ，Ｂ，Ｃ常数A主要表示柱填充的好坏，A一般在0.5~1之间，A

>2表示柱填充有问题；B反映柱中洗脱剂的路径以及由于填料的存在而阻碍溶质扩散的程度，B要求小于４，约为２最好；C表示溶质在流动相合固定相之间质量转移的效能，折合流速较高时，其贡献较大，薄可填料C≈０，对多孔填料数值较大，一般0.05较为合适。第74页，共106页，2023年，2月20日，星期三第75页，共106页，2023年，2月20日，星期三折合参数及其lgh-lgv图是目前广泛用来表示柱效能的一种方法，它与填充材料的粒度大小无关，在实际过程中用于比较不同粒度填充的色谱柱的效能，并可使用统一的标准来衡量柱的质量。第76页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.5柱外效应除了第一项外，其它引起色谱峰扩展的因素均称为柱外效应。气相色谱柱体积较大，柱外效应一般较小；液相色谱色谱柱体积小溶质扩散系数很低，柱外效应对色谱区带的扩展影响不可忽略。第77页，共106页，2023年，2月20日，星期三进样进样是柱外效应引起色谱峰扩展的一个主要原因。典型进样方式：塞子型和指数型。指数型进样在进样系统死体积过大时出现，此时样品在柱头上的浓度可用指数衰减型函数表示。Sternberg提出以体积表示为：

进样体积越大，引起的柱外效应越大。第78页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.6等温线的影响在分析型色谱分离条件下，溶质的分配系数与其浓度无关，溶质在固定相中的浓度对其在流动相中浓度作图是一条直线，斜率为分配系数，该图是在等温条件下获得的，故称之为等温线。线性等温线得到对称色谱峰，其峰宽取决于色谱柱的动力学性质，是线性色谱的基础。第79页，共106页，2023年，2月20日，星期三第80页，共106页，2023年，2月20日，星期三

如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示：

式中：C—不同时间t时某物质的浓度，C0—进样浓度，tr—保留时间，σ—标准偏差。第81页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.7分离度与色谱特性色谱分离中常称两相邻色谱组分为“物质对”，混合物分离条件的选择，主要是提高最难分离物质对的分离度。实际过程中测量分离度用如下公式：第82页，共106页，2023年，2月20日，星期三分离度与各种色谱参数关系的通用方程式如下：R为分离因子，

α选择性因子，k2为后洗脱的色谱峰的容量因子。α和k值的大小取决于色谱系统与“物质对”的热力学性质，N,H决定于色谱系统的动力学性质。α值与流动相、固定相的性质和相比有关；N,H，由板高方程各项参数决定，一般随色谱柱长、流动相流速和温度等操作条件变化。第83页，共106页，2023年，2月20日，星期三影响分离度的各项因素优化第84页，共106页，2023年，2月20日，星期三容量分子对分离度的影响当k很小时，k↑，k/k+1↑，R↑；当k>5以后，k↑，R的增加非常缓慢；当k>10后，k↑，R的变化很小，但分离时间增长，并使色谱峰扩展。从分离速度和分离度考虑，有一个最佳的k值，约为2≤k≤5。对于多元混合物分离，色谱峰容量与k有关，k增大峰容量增大，因此一般选择色谱条件为1≤k≤10。第85页，共106页，2023年，2月20日，星期三如何调节k气相色谱主要通过改变固定相和固定相用量来调节k；液相色谱主要改变流动相组成，控制溶剂强度来调节k值，要增加k，则降低溶剂强度。分离沸点范围宽，极性范围相差大的多组分混合试样，采用恒温或等梯度洗脱，难以达到最佳k值，此时气相色谱采用程序升温，液相色谱采用梯度洗脱来调节合适的k值范围。第86页，共106页，2023年，2月20日，星期三选择性因子对分离度的影响α=1两组分不能分离，若略大于1就可实现分离；α=2分离是相当容易的。α>1，（α-1）/α从0.001一直增加到接近1，变化范围达到103。相比之下，k从1增加到50，k/1+k从0.5变到接近1，变化范围只有0.5，显然α是提高分离度的更重要变量。采用提高k值的方法提高分离度时，分离时间增加；而提高α增加分离度可使分析时间缩短。第87页，共106页，2023年，2月20日，星期三如何调节α气相色谱主要通过选择合适的固定相和降低柱温来提高α值；液相色谱，改变固定相和流动相的性质均能提高α值，通常采用改变流动相的组成和极性来提高α值；对于多组分复杂混合物的分离，主要通过提高最难分离物质对的α值。发展新型色谱柱材料和色谱类型，是设计高选择色谱体系的重要途径。第88页，共106页，2023年，2月20日，星期三根据分离度求得塔板高和柱长第89页，共106页，2023年，2月20日，星期三在实际分离中，一般根据初步分离条件下的色谱柱效(N1)、柱长(L1)、获得的分离度(R1),计算获得更高或指定高度所需理论塔板数（N2)和柱长（L2),即：若塔板高度不变，从一根柱长下的分离度R1可计算另一根柱长下的分离度，即：第90页，共106页，2023年，2月20日，星期三例如，初步分离条件为柱长100mm,分离度R=0.75，欲完全分离（R=1.5),即提高分离度1倍，则：即柱长增加3倍，但分离时间与柱长的平方成正比，即柱长增加，分离速度下降，因而要适当增加柱长。实际过程中，一般不采取增加柱长的方法提高分离度。第91页，共106页，2023年，2月20日，星期三色谱的线性容量（linearycapacity)范围每一种色谱固定相都有一定的线性容量范围，在该范围内，进样量增加，色谱峰增大，色谱区域宽度和保留时间不变。当样品量超过线性容量范围时，进样量增加，k下降（有时也上升）。溶质的k降低10%（相对于低进样量测定的k值)时的样品量，为固定相的样品容量，以θ0.1表示。（柱效降低10%）第92页，共106页，2023年，2月20日，星期三固定相的样品容量对于分析性分离，一般进样量保持在线性容量范围内。制备性分离常超过柱容量范围。色谱柱的容量决定于固定相的性质和用量。气相色谱，随着色谱柱固定液用量的增加，样品容量增加；液相色谱，采用全多孔固定相填料比薄壳型填料的样品容量高。第93页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.8色谱分离条件的优化指标（1）色谱响应函数CRF如何评价色谱分离的好坏，不同研究者提出不同的最优化指标，把分离度、分离时间和色谱峰总数作为同等重要的参数考虑，提出色谱响应函数CRF。Ri为第i个相邻峰对的分离度；n是洗出峰的个数；tx是最长允许分析时间，tn为实际分析时间；t0是最小允许保留时间，t1是第一个峰的实际保留时间；a、b、c分别为各个因素的权重系数。第94页，共106页，2023年，2月20日，星期三未知混合物，评价分离时不仅要看相邻峰的分离度，还要看洗出峰的多少和全部色谱峰洗出的时间。（全面分离分析）由上式可知，n越大，tn越小，t1越大，Ri越大，则CRF越大，分离效果越好。出峰数目n，不能靠增大Ri，tx-tn，减小t0-t1来实现。第95页，共106页，2023年，2月20日，星期三（2）色谱优化函数COFRid为第i个相邻峰对的期望分离度，tx是最长允许分析时间，tn为实际分析时间；Ai和B为权重系数，Ai可以调整不同峰对的分离在优化过程中所占的比重，分离的好的色谱图COF值是一个绝对值很小的负值（零为最佳），其绝对值越大表明分离情况越差。第96页，共106页，2023年