生物大分子结构与功能蛋白质的柔性结构

第五章：蛋白质的柔性结构目前一页\总数一百一十二页\编于二十点

天然折叠的蛋白分子往往不是以一种构象状态存在的。在晶体结构中我们看到的往往仅是一种状态的构象，它是蛋白质分子的一个平均构象。实际上，蛋白质分子始终是处于一种呼吸的状态。蛋白质结构中所有的原子都在运动，这些原子的运动通常是随机的，但有时可以是集合性的运动。这种集合性的运动引起分子中的原子团在相同的方向上产生运动，造成蛋白质分子中的侧链可以从一种构象转化为另一种构象。某些环区域也并不总是固定在一种单一的构象状态，螺旋也可以互相产生滑动，完整的结构域之间也可以改变它们的堆积接触以打开或关闭结构域之间的距离。通常这些运动都是比较小的，有时小到仅有1/10Å

的运动，但有时这种集合性运动可以很大，大到足以具有重要的生物学意义。目前二页\总数一百一十二页\编于二十点

这样大的集合性运动在X-射线晶体学研究中所表现出来的是电子密度的水平低，甚至在某些情况下看不到电子密度的存在。产生这样的运动的区域通常在晶体学中被表述为柔性(flexibility)运动或无序(disorder)。核磁共振实验对于这样的区域的测定可以作为一种互补，因为核磁共振实验可测出这些区域的各种不同的构象，通过理论计算也可以计算出这些分立的或集合性运动这叫作分子动力学模拟。目前三页\总数一百一十二页\编于二十点

分子动力学模拟已经表明，每一个分立的残基的集合性运动仅在皮秒(10-12

秒)的时间尺度，而环区域的运动在纳秒(10-9秒)的尺度。这种运动对于许多蛋白质的功能是非常重要的。象电子转移和配基结合或释放反应均以这样的时间尺度发生，并通常伴随着蛋白质原子的运动。例如，当肌红蛋白呼吸时，通道在溶剂和被包埋在分子内部的结合部位之间打开，以允许氧原子在纳秒的时间尺度范围与肌红蛋白结合或者释放出来。

除了蛋白质中原子小的呼吸运动之外，在分子的功能态之间也会发生大的构象变化。不同的pH和配基的存在和缺失以及环境中的微小的变化，往往能够稳定蛋白质的不同构象态。这些构象变化可以是活性部位的氨基酸侧链的构象变化到环区域的运动等。同时结构域之间的相对取向和寡聚蛋白中四级结构也会发生变化，这样的运动通常是与功能相关的。例如酶的催化，肌肉运动和能量转换等。目前四页\总数一百一十二页\编于二十点真核细胞周期的五个相(G0,G1,S,G2和M相)例1：细胞周期调节蛋白激酶的构象变化在S相，DNA合成，DNA被复制并且染色体翻倍。在M相，有丝分裂父代细胞的二倍化染色体通过有丝分裂的纺锤体分开，这样每个子代细胞接收到相同组分的染色体。

一个细胞分裂的完整周期是MG1S和G2。通过G1S和G2相，细胞的蛋白质合成机器大分子和细胞器被建立起来，同时细胞的体积增大。在有丝分裂时，染色体和细胞质被分为两个相等的部分。此外，还有一个静止相G0相，发生在细胞的未分裂状态。目前五页\总数一百一十二页\编于二十点由cyclin的降解对CDKs的调节细胞周期的进程取决于一系列的叫作cyclin依赖的蛋白激酶(cyclin-dependentproteinkinases,CDKs)的连续激活作用。图中显示两种类型的cyclin-CDK复合物，一种是触发S相，另一种触发M相。在这两种情况下CDK的激活需要与cyclin的结合，它们的非活性依赖于cyclin的降解在脊椎动物的细胞中至少有四种不同CDKs，控制着细胞周期的活动。不同的催化亚基都属于密切相关的基因家族，不同的CDK的一个或几个cyclin分子都是该家族的成员。CDKs作为一个延迟开关，控制着从G1相到S相从G2相到M相以及所有构成细胞周期的其它步骤目前六页\总数一百一十二页\编于二十点

人的体细胞中调制DNA复制的CDK2-cyclinA的结构提供了详细的结构信息以及cyclinA激酶的功能。CyclinA的功能片段的晶体结构于1995年由LouiseJohnson实验室解出，非活性的CDK2的结构1993年已由Sung-hoKim实验室解出，活性的cyclinA片段与CDK2复合物的结构也于1995年由NicolaPavletich实验室解出。通过对这些结构的分析和结构比较，揭示出cyclinA是如何结合到CDK2上，并如何在CDK2的活性部位引起大的构象变化，使CDK2蛋白质从一种非活性的状态转变为活性状态的。而在此过程中cyclinA的结构则没有发生构象变化cyclinA依赖型激酶CDK2的结构cyclinA依赖型激酶CDK2有两个结构域，N-端结构域由一段α螺旋β折叠片组成，在α螺旋中PSTAIRE的氨基酸顺序（红色）在所有的CDKs蛋白激酶中都是高度保守的；C-端结构域主要由α螺旋组成，并含有一段柔性的环区域称作T-loop

（黄色）环区域，含有一个苏氨酸残基，在完全活性的酶中该苏氨酸残基被磷酸化。目前七页\总数一百一十二页\编于二十点CyclinA的结构CyclinA活性片段残基173-432的结构由两个非常相似的结构域构成。每个结构域都由五段α螺旋组成。该活性片段的作用几乎与完整的cyclinA分子的作用相同。在所cyclinA中第一个结构域具有十分保守的氨基酸顺序被称作Cyclin-box

，而第二个结构域的氨基酸顺序则不相同。因此尽管cyclinA片段的两个结构域结构几乎相同但仅有一个Cyclin-box序列。目前八页\总数一百一十二页\编于二十点活性的CDK2蓝色和cyclinA复合物的结构在cyclinA-CDK2复合物中，主要是CyclinA与CDK2中的PSTAIRE螺旋和T-loop相互作用，cyclin-box螺旋2-6与CDK2的PSTAIRE深红色螺旋和T-loop黄色作用。在该复合物中，cyclinA的结构与单个cyclinA是相同的，而CDK2的结构则发生了很大的构象变化，包括PETAIRE螺旋T-loop和ATP的结合部位（浅红色）。整个N端结构域相对于C端的结构域的取向发生了变化，此外PSTAIRE螺旋向CDK2的活性部位靠近并旋转了90°，以便主要的催化残基Glu51指向裂缝，而不是象在单个的CDK2结构中那样远离此裂缝。目前九页\总数一百一十二页\编于二十点CDK2与cyclinA结合的构象变化一旦与cyclinA结合，PSTAIRE螺旋橙色转动90°，并改变位置以使得Glu51变为指向活性部位。该PSTAIRE螺旋的一些主链原子由于这种一致性运动位移了8.0Å的距离。T-loop发生了大的位置重排某些环区域上的氨基酸残基的位移可达20Å。左图：在非活性态，PSTAIRE螺旋红色的取向使Glu51指向远离ATP的结合部位，而T-loop封住了与底物的结合部位，以阻止蛋白结合到CDK2上。右图：在活性的cyclinA-CDK2复合物结构中，PSTAIRE螺旋发生了重新定向以使得Glu51残基指向活性部位并与另一个与催化有关的残基Lys33形成盐键，T-loop改变了构象并与另一个残基Asp145一起与活性部位中的镁离子配位，此时底物的结合部位被打开，蛋白可以结合底物。cyclin-CDK2复合物可以磷酸化Ser/Thr残基并进而激活所结合的蛋白。在自由CDK2T-loop结构中的α螺旋在复合物中变为一条β

链。目前十页\总数一百一十二页\编于二十点cyclin结合引起CDK2的结构变化(a)活性部位位于N端结构域（蓝色）和C端结构域（紫色）之间的裂缝中，在非活性状态此活性部位被T-loop所封闭。(b)在活性的cyclin结合状态的CDK2结构中,Tloop的结构发生了变化,活性部位被打开,Thr160适合于磷酸化.由于cyclinA的结合所引起的CDK2的构象变化,不仅暴露了活性部位的裂缝以使ATP和蛋白底物能够与之结合,而且活性部位的残基发生了重排,以形成酶的催化作用。此外Thr160被暴露出来，并准备被磷酸化以提高催化活性。简而言之蛋白质结构的柔性调节了CDK家族的酶活性，因而控制了细胞周期。目前十一页\总数一百一十二页\编于二十点StructuralbasisofinhibitionofCDK-cyclincomplexesbyINK4inhibitorsPhilipD.Jeffrey,LilyTong,andNikolaP.PavletichCellularBiochemistryandBiophysicsProgramandHowardHughesMedicalInstitute,MemorialSloan-KetteringCancerCenter,NewYork,NewYork10021,USAGenesDev.200014:3115-3125目前十二页\总数一百一十二页\编于二十点Thecyclin-dependentkinases4and6(Cdk4/6)thatdriveprogressionthroughtheG1phaseofthecellcycleplayacentralroleinthecontrolofcellproliferation,andCDKderegulationisafrequenteventincancer.Cdk4/6areregulatedbytheD-typecyclins,whichbindtoCDKsandactivatethekinase,andbytheINK4familyofinhibitors.Thestructurerevealsthatp18-INK4cinhibitstheCDK–cyclincomplexbydistortingtheATPbindingsiteandmisaligningcatalyticresidues.p18INK4calsodistortsthecyclin-bindingsite,withthecyclinremainingboundataninterfacethatissubstantiallyreducedinsize.TheseobservationssupportthemodelthatINK4bindingweakensthecyclin’saffinityfortheCDK.ThisstructurealsoprovidesinsightsintothespecificityoftheD-typecyclinsforCdk4/6.目前十三页\总数一百一十二页\编于二十点

Overallstructureofthep18–Cdk6–K-cyclincomplexandcomparisonwithCdk2–cyclinA

Schematicviewofp18–Cdk6–K-cyclin.p18isshowninyellow,Cdk6incyan,K-cyclininpurple.TheTloopandPSTAIREelementsofCdk6arehighlightedinred,andthehelicesofthefirstcyclinrepeatarelabeled.NandCterminiarelabeledwherevisible.Thep18–Cdk6andK-cyclin–Cdk6interfacesdonotoverlapandlieonoppositesidesofthekinase,buryingatotalof4350Å2ofsurfacearea.(B)Topviewofthep18–Cdk6–K-cyclincomplex,approximatelyorthogonaltoviewinA.Theankyrinrepeatsofp18arenumbered.ThePSTAIREhelixiscentraltotheCdk6–K-cyclininterface,buttheTlooppacksontheothersideofthekinase.(C)ViewofCdk2–cyclinAcomplexsuperimposedontheClobeofCdk6inthesameorientationasinA.BoththePSTAIREhelixandTloop,inred,packagainstcyclinA.(D)ViewofsuperimposedCdk2–cyclinAcomplexfromsameviewpointasB.目前十四页\总数一百一十二页\编于二十点TheCdk6structureinthep18–Cdk6–K-cyclincomplexhasalargenumberofconformationalchangescomparedwiththeactiveconformationofCdk2(Jeffreyetal.1995;Fig.2C,D)orofotherproteinkinases.InthisinactiveCdk6structure,theNandClobesarerotated13°awayfromeachother,resultinginthemisalignmentofATP-bindingresidues.TheN-lobePSTAIREhelix,whichcontainsaninvariantactivesiteresidue(Glu61),isdisplacedby4.5Åawayfromtheactivesiteandisrotatedby16°.AC-lobeloop(Tloop,residues162–182),whichcontainsthethreoninethatisphosphorylated(Thr177)onthefullactivationofthekinase(Morgan1995;Russoetal.1996)andthatformspartofthepolypeptidesubstrate-bindingsite(Brownetal.1999),isdisplacedby>30Å.Finally,anadditionalloopatthebackofthecatalyticcleft(residues99–102),whichwouldhydrogenbondtoATP,isdisplacedbyseveralÅngstroms.目前十五页\总数一百一十二页\编于二十点TheCdk2–cyclinAstructure(Jeffreyetal.1995)showedthatcyclinAbindingtoCdk2causedconformationalandpositionalchangesinthePSTAIREhelixandTloopandthatthesechangesactivatedthekinasebycorrectlyaligningcertainactivesiteresiduesandreorganizingthepolypeptidesubstratebindingsite.Inthep18–Cdk6–K-cyclincomplex,notonlydoestheK-cyclinfailtocarryoutmostoftheseconformationalchangesbutp18causesthemisalignmentofadditionalresiduesinvolvedinATPbindingandcatalysis.目前十六页\总数一百一十二页\编于二十点StructureoftheCdk6–K-cyclininterface(A)ThePSTAIREhelixofCdk6isacentralfeatureoftheCdk6–K-cyclininterface.TheviewpointshowncorrespondsapproximatelytothatinB.Threesetsofinteractionsareshown:hydrogenbondsbetweentheCdk6main-chainprecedingthePSTAIREhelixandtheconservedLys–GlupairofK-cyclin(K106,E135);theconservedIle59ofCdk6insertsintoahydrophobicpocketinK-cyclin;residuesattheendofthePSTAIREhelix,oneturnlongerinCdk4andCdk6thaninCdk2,interactwithresiduesontheN-terminalhelixofK-cyclinandmayplayaroleincyclin–CDKspecificity.(B)Surfacerepresentationofp18–Cdk6–K-cyclincomplexillustratingtheminimalinteractionsbetweenK-cyclinandtheCdk6Clobe.p18iscoloredyellow,theCdk6Nlobeiscyan,theCdk6Clobeisblue,andtheK-cyclinispurple.TheonlycontactsbetweenK-cyclinandtheClobeofCdk6arisefrominteractionswiththeN-terminalhelixofK-cyclin.(C)SurfacerepresentationofCdk2–cyclinAintheequivalentorientationasthatinA,showingsignificantlygreaterinteractionsbetweentheClobeoftheCdk2andthecyclinA,givingrisetoamuchmoreextensivecyclin–CDKinterface.目前十七页\总数一百一十二页\编于二十点TheATP-bindingsiteofp18–Cdkl6–K-cyclinandCdk2–cyclinA.ActivesiteresiduesimplicatedinATPbindingandcatalysisaredisplacedinthep18–Cdk6–K-cyclincomplexrelativetotheactiveCdk2–cyclinAconformation.Cdk2andCdk6weresuperimposedontheirClobes.Cdk6isshownincyan,p18inyellow,Cdk2ingray.Movementofactivesiteresiduesisindicatedbyredarrows.p18displacestheNloberelativetotheClobe,causingthehydrophobicresidues(Ile19,Val27,Ala41,Leu152)thatsandwichtheadenineringofATPtomovebyupto4.5Å.Thep18inhibitoralsodistortstheedgeoftheactivesiteviaPhe82,affectinghydrogenbondinginteractionswiththeedgeoftheATPring.TherelatedshiftofthePSTAIREhelixontheothersideoftheactivesitedisplacesanactivesiteresidue(Glu61).TheTloopofCdk6divergesfromthatofCdk2betweenPhe164andVal181TheINK4-inducedconformationalchangesinCdk6wouldinterferewiththebindingofATPandpolypeptidesubstrateandwouldalsomisalignanyweaklyboundsubstrateswithrespecttophosphotransfer.目前十八页\总数一百一十二页\编于二十点ThedifferenceswithrespecttoCdk2–cyclinAarisefromcontactsattheCterminusofthePSTAIREhelixcausedbyathreeresidueinsertioninCdk6(residues70–72)resultinginoneadditionalhelicalturnof3.10type.ThelongerPSTAIREhelixofCdk6wouldcollidewiththeN-terminalhelixofcyclinA(Thr70andPhe71ofCdk6wouldclashwithMet189andTyr185ofcyclinA).ThelongerCdk6PSTAIREhelixisaccommodatedinK-cyclinbyasmallshiftoftheN-terminalhelixrelativetocyclinAandbythesubstitutionofsmalleraminoacids(Asn24ofK-cyclininsteadofTyr185ofcyclinA).ThisresultsincontactsbetweenThr70andPhe71intheCdk6insertionandAsn24,Ile28,andPhe32ofK-cyclin.目前十九页\总数一百一十二页\编于二十点ThestructureofCdk6inthep18–Cdk6–K-cyclincomplexdiffersfromthestructureofcyclinA-activatedCdk2intheorientationoftheNandClobesofthekinaseandinthepositionsofthePSTAIREhelixandTloop.ComparedtotheCdk2–cyclinAcomplex,thekinaseNandClobesofthep18–Cdk6–K-cyclincomplexarerotatedby13°aboutanaxisthatpassesthroughthebackofthecatalyticcleftandisapproximatelyperpendiculartotheplaneoftheATPthatwouldbindthere.TherotationoftheNlobeandthePSTAIREhelixawayfromtheClobeisalsoassociatedwiththeTloopnotadoptingtheconformationneededforsubstratebindingandkinaseactivity.IntheCdk2–cyclinAcomplex,theTloopmakesmultiplecontactswiththePSTAIREhelix,thecyclin,andotherpartsoftheClobe.Asthesecontactswouldnotbepossibleinp18–Cdk6–K-cyclinbecauseofthemisalignmentofthelobesandPSTAIREhelix.目前二十页\总数一百一十二页\编于二十点DespitetheoverallsimilaritiesintheNlobe-cyclininteractionsbetweentheinhibitedp18–Cdk6–K-cyclincomplexandtheactiveCdk2–cyclinAcomplex,thereisalargedifferenceinthepositionandorientationofthecyclinrelativetothekinaseClobe.WhenthetwocomplexesarecomparedbysuperimposingtheirCDKClobes,K-cyclinisrotatedby≈40°,anditscenterofgravityisshiftedby15ÅrelativetocyclinA.ThisiscausedinpartbytherotationbetweenthekinaseNandClobesinp18–Cdk6–K-cyclinandinpartbytherotationofthePSTAIREhelixrelativetotheNlobe.TheshiftinK-cyclinleadstoalackofsignificantcontactsbetweenK-cyclinandtheClobeandTloopofCdk6(Fig.4B).IntheCdk2–cyclinAcomplex,thereareextensivecontactsbetweenthefirstcyclinrepeatandtheTloopandbetweentheN-terminalhelixandotherpartsoftheCdk2Clobe(Fig.4C;Jeffreyetal.1995).IntheinhibitedCdk6–K-cyclincomplex,therearenocontactswiththeTloopandonlyafewminorcontactswiththeClobe.目前二十一页\总数一百一十二页\编于二十点ConformationofCdk6SchematicrepresentationofthedifferentconformationsoftheCDK.CDKsundergoextensiveconformationalchangesonbindingofactivatingorinhibitingsubunits.ThemajordeterminantsofactivityarethepositionsandconformationofthePSTAIREhelixandTloop,aswellastherelativedispositionofthekinaseNandClobes.ThePSTAIREhelixadoptsapositionfurtherawayfromthecatalyticcleftininactiveCDKs(labeledas‘out’)thaninactiveCDKs(‘in’).ThePSTAIREhelixconformationcorrelateswiththelocationofaconservedactivesiteresidue(Cdk2,Glu51;Cdk6,Glu61)eitherinsideoroutsidethecatalyticcleft.目前二十二页\总数一百一十二页\编于二十点例二：肽与钙调蛋白(Calmodulin)的结合钙调蛋白是一个含有148个氨基酸残基的钙结合蛋白，它与钙依赖性的信号通道的过程有关。钙调蛋白可结合到多种蛋白中，像激酶钙泵蛋白，以及一些运动性蛋白等，以调节这些蛋白的活性。这些蛋白的钙调蛋白结合区域大约由20个相邻的残基组成，虽然它们的氨基酸顺序变化很大，但它们都有形成α螺旋的强烈倾向，单个的和与多肽结合的钙调蛋白的结构表明，多肽的结合引起了钙调蛋白分子中大的构象变化。Calmodulin(CaM)(anabbreviationforCALcium-MODULatedproteIN)isacalcium-bindingproteinexpressedinalleukaryotic

cells.Itcanbindtoandregulateanumberofdifferentproteintargets,therebyaffectingmanydifferentcellularfunction.目前二十三页\总数一百一十二页\编于二十点CaMmediatesprocessessuchasinflammation,metabolism,apoptosis,smoothmusclecontraction,intracellularmovement,short-termandlong-termmemory,nervegrowthandtheimmuneresponse.CaMisexpressedinmanycelltypesandcanhavedifferentsubcellularlocations,includingthecytoplasm,withinorganelles,orassociatedwiththeplasmaororganellemembranes.ManyoftheproteinsthatCaMbindsareunabletobindcalciumthemselves,andassuchuseCaMasacalciumsensorandsignaltransducer.CaMcanalsomakeuseofthecalciumstoresintheendoplasmicreticulum,andthesarcoplasmicreticulum肌浆网.CaMundergoesaconformationalchangeuponbindingtocalcium,whichenablesittobindtospecificproteinsforaspecificresponse.CaMcanbinduptofourcalciumions,andcanundergopost-translationalmodifications,suchasphosphorylation,acetylation,methylationandproteolyticcleavage,eachofwhichhaspotentialtomodulateitsactions.Calmodulincanalsobindtoedemafactortoxinfromtheanthrax炭疽bacteria.目前二十四页\总数一百一十二页\编于二十点与肽结合的钙调蛋白的构象变化(a)在自由状态下钙调蛋白是一个由两个结构域（红色和绿色）组成的哑铃状分子。每个结构域都有两个与钙结合的EF手（EF-hand）

(b)在结合肽的状态，α

螺旋连接子α-helixlinker已被切开，分子的两端紧靠在一起，并形成一个致密的球状复合物。每个结构域的内核结构基本上没有变化，结合肽形成一段α螺旋，每个结构域内含有两个EF手，每个EF手结合一个钙离子。这两个结构域显然在空间上是互相靠近的，并在α

螺旋连接子的两端分开。当钙调蛋白与它的配基结合时实际上仅有5个基团改变了构象。这是α螺旋连接子中的5个保守残基，这5个残基发生了解旋并形成一个环区域，虽然在此环区域之后仍是一个α螺旋，但其方向发生了很大的变化。第二个螺旋以完全不同的取向与第一个螺旋靠近多肽，构象如此小的局部变化引起了如此大的结构域之间的变化，这是由配基引起蛋白变化的最大的一种蛋白。目前二十五页\总数一百一十二页\编于二十点Thereare4helix-loop-helix(EF-hand)motifs目前二十六页\总数一百一十二页\编于二十点Uponbindingofsometargetsequencestocalmodulin,thetwodomainscometogethertoformahydrophobicchannelCalmodulinisonlyactivewhenallfoursitesarefilled.

ThebindingofthefourCa++ionsiscooperative

目前二十七页\总数一百一十二页\编于二十点Mechanism:CalciumisboundviatheuseoftheEFhandmotif,whichsuppliesanelectronegativeenvironmentforioncoordination.Aftercalciumbinding,hydrophobic

methylgroupsfrommethionineresiduesbecomeexposedontheproteinviaconformationalchange.Thispresentshydrophobicsurfaces,whichcaninturnbindtoBasicAmphiphilic两性的Helices(BAAhelices)onthetargetprotein.Thesehelicescontaincomplementaryhydrophobicregions.TheflexibilityofCalmodulin'shingedregionallowsthemoleculeto"wraparound"itstarget.Thispropertyallowsittotightlybindtoawiderangeofdifferenttargetproteins.

目前二十八页\总数一百一十二页\编于二十点CalmodulinwrapsaroundatargetdomainofsomeproteinsonlyafterbindingCa++.Otherproteinshaveboundcalmodulinaspartoftheirquaternarystructure,evenintheabsenceofCa++.Ineithercase,aconformationalchangeinducedbybindingofCa++tocalmodulinalterstheactivityofthetargetprotein.目前二十九页\总数一百一十二页\编于二十点CAMishighlyconservedacrossalleukaryotes目前三十页\总数一百一十二页\编于二十点Onceinthecytosol,theCa++typicallybindstoasmallprotein,calmodulin.Once

fourCa++bindtocalmodulin,itactivatesspecificproteinsinsidethecell,sucharecertainproteinkinases.目前三十一页\总数一百一十二页\编于二十点目前三十二页\总数一百一十二页\编于二十点Ca2+-independentbindingofcalmodulintoitstargetproteins

bycontrast,usesaconsensussequence(IQxxxRGxxxR)calledanIQmotif.SomeproteinsbindcalmodulinthroughtheirIQmotifsatlowconcentrationsofCa2+.AsubsequentincreaseintheCa2+concentrationinducesaconformationalchangeintheboundcalmodulin,regulatingtheactivityofthetargetprotein.

HowdoesCalmodulinbindtoproteins?目前三十三页\总数一百一十二页\编于二十点AtransformationofthecorrespondingIQ12regionofscallopmusclemyosin-II.Martin&Bayley,2002.

目前三十四页\总数一百一十二页\编于二十点Diseasestatescharacterizedbyunregulatedgrowth,suchascancer,arecorrelatedwithelevatedlevelsofCa++-boundCaMSomeAnti-calmodulinDrugsCAM’shydrophobicsurfacecanbinddifferentaromaticmolecules目前三十五页\总数一百一十二页\编于二十点Calmodulin1(phosphorylasekinase)isaproteinthatinhumansisencodedbytheCALM1

gene.Calmodulin1isthearchetypeofthefamilyofcalcium-modulated(calmodulin)proteinsofwhichnearly20membershavebeenfound.Theyareidentifiedbytheiroccurrenceinthecytosoloronmembranesfacingthecytosolandbyahighaffinityforcalcium.Calmodulincontains148aminoacidsandhas4calcium-bindingmotifs.Itsfunctionsincluderolesingrowthandthecellcycleaswellasinsignaltransductionandthesynthesisandreleaseofneurotransmitters.Calmodulin1hasbeenshowntointeractwithAKAP9,3TRPV1,4Androgenreceptor,5IQGAP167andPPEF1Calmodulin2

(phosphorylasekinase)isaproteinthatinhumansisencodedbytheCALM2

gene,CALM2hasbeenshowntointeractwithAKAP9Calmodulin3(phosphorylasekinase)isaproteinthatinhumansisencodedbytheCALM3

gene

Calmodulin-likeprotein1Calmodulin-likeprotein2Calmodulin-likeprotein3Calmodulin-likeprotein4Calmodulin-likeprotein5Calmodulin-likeprotein6

目前三十六页\总数一百一十二页\编于二十点例三：Serpin抑制丝氨酸蛋白酶的作用

α1抗胰蛋白酶属于在血浆中发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员，统称叫作Serpin。该家族的其它成员是抗凝血酶(antithrombin)和血浆酶原激活子抑制剂(PlasminogenActivatorInhibitor,PAI)，两者都是血液凝集连锁反应的调节子。所有的Serpin分子都是同源的，且都有非常相似的三维结构。这些Serpin分子在各种不同状态下的一般折叠是相同的，但是柔性环区域的位置则变化很大。目前三十七页\总数一百一十二页\编于二十点卵白蛋白的Serpin折叠由三个反平行的β

折叠AB和C构成。红色区域是Serpin相应的活性部位，该部分像一个结构的把手一样穿出卵白蛋白，可把非切断形式的卵白蛋白结构考虑为规范的Serpin的结构。β

折叠片A(β-sheetA)有五段β

链，柔性的环区域起始于β折叠片A的链5的末端，然后形成一段位于分子顶端的α螺旋，并靠近β

折叠片C的边缘，最终在β折叠片B的起始链结束。目前三十八页\总数一百一十二页\编于二十点三种状态下活性部位环区域红色的图解活性形式下，环区域从分子的主要部分穿出，与丝氨酸蛋白酶的活性部位发生作用(b)作为抑制蛋白酶的结果，Serpin分子在环区域的活性部位的尖端被切断，被切断的形式中环区域的N端把它自己插入到β5和β15之间，并在β折叠片的中部形成一条长的β

链（红色）。(c)在最稳定的状态（潜伏态），该形式是无活性的。环区域的N端部分形成一个被插入的β

链，其余的残基在β

折叠片的另一端形成一个环区域。进一步说，在环区域中没有任何α螺旋延伸到分子主体的外部，以准备插入到凝血酶的活性部位。目前三十九页\总数一百一十二页\编于二十点活性形式到隐性形式(latentform)的转变包含了结构中由一个环转变为一段长的β

链插入到β折叠片的中间。为了使得这种结构的转变得以实现，在β

折叠片中的相邻的β

链首先必须要被分开以允许新的β链的插入，这牵涉到在一个稳定的β

折叠片中的两条相邻的β链之间的氢键的断裂和分子内部的疏水堆积的接触相互作用的改变。当新的β

链插入以后，形成新的氢键和疏水堆积相互作用，这种在β

结构中的主要变化，在serpin结构被测定之前，是人们所预料不到的，在许多其它的系统中也没有观察到这种现象。肺气肿(emphysema)的发生常常是与serpin抗胰蛋白酶的专一性突变相关的。突变的serpin分子在肝内产生聚集，引起血浆中的抗胰蛋白酶的缺乏，进而造成肺中的弹性蛋白(elastin)纤维被弹性蛋白酶的酶解的增加。研究表明serpin在胞内聚集的形成，是由于突变的抗胰蛋白酶的折叠速度极慢，导致折叠中间物的累积形成聚集。这是不完全折叠或错误折叠的分子导致病变或严重疾病的一个例子。通过对这些由蛋白质分子的折叠和错误折叠过程的了解，人们可以进行相应的药物设计去治疗这些疾病。目前四十页\总数一百一十二页\编于二十点例四：分子的R态和T态间的别构蛋白效应子分子开关早在1963年J.Monod,J.-P.Changeaux和F.Jacob就提出了别构控制的理论。该别构控制的理论提供了对于象酶的反馈抑制配基与蛋白的协同性结、氧与血红蛋白的结合等的分子间相互作用的理论依据。别构理论有下列主要的特性：由别构效应子分子作用造成的协同底物结合和蛋白活性修饰与蛋白质结构中的两个或多个构象态相关，底物和效应子在蛋白质的不同部位上结合，因此两者没有立体化学的关系，因而被称之为别构（不同的形状）。别构理论预测出这些蛋白是由几个对称排列的亚基组成的，两种态之间是由于亚基的排列不同和它们之间的键的数目不同。一种态是亚基由强键所限制，这样就不能满足与底物结合所需要的结构变化，与底物的结合能力弱，称作Tense(T)态，另外一种态与之相反称作Relaxed(R)态。目前四十一页\总数一百一十二页\编于二十点一致性模型(concertedmodel)的模型，进一步假定分子的对称是守恒的，因此所有的亚基的活性要么是同等地低或者是同等地高，即所有的结构变化是一致的。连续模型(sequentialmodel)。该模型认为在结构中每个亚基可独立地在底物的结合部位变化，它的三级结构在此模型中亚基与它的结合配基的三级结构变化改变了这个亚基和与它相邻的亚基的相互作用，进而导致另一个亚基的活性部位的变化。例如由配基对酶的结合引起酶的构象变化使酶由非活性状态变为有活性。别构效应模型目前四十二页\总数一百一十二页\编于二十点磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase,PFK)的别构效应磷酸果糖激酶是糖酵解路径中的一个关键的调节酶，它使葡萄糖分解以产生ATP。该酶催化糖酵解路径中果糖-6-磷酸,F6P

的ATP磷酸化生成果糖-1,6-二磷酸的前期步骤。磷酸果糖激酶可被糖酵解途径中最后一步所产生的产物-磷酸烯醇丙酮盐酸(phosphoenolpyruvate,PEP)所抑制，也可被PEP的类似物，例如2-磷酸羟乙酸盐(phosphoglycolate)所抑制一个四聚体的大肠杆菌的PFK的每个亚由320个氨基酸组成，排列为两个结构域：一个大结构域一个小结构域这两个结构域都有一个α/β

结构。从多肽链的氨端到羧端，螺旋被标记为从A到M，β

链标记为1到11。底物和效应子分子的结合部位以灰色标记。一个亚基的效应子部位通过螺旋F和链6之间的6-F环连接到二体的另一个亚基的活性部位。亚基被配对连接为两个二体。目前四十三页\总数一百一十二页\编于二十点磷酸果糖激酶的四级结构及其相互作用(a)四个亚基配对排列为两个二体A-B(蓝色)和C-D(红色或绿色)，二体内的亚基相互用紧密，而两个二体之间互相紧密地堆积在一起。在R态和T态时的二体堆积相互作用有差异，在R态(红色表示的C-D二体)和T态(绿色)下二体的相对取向转动了7°。(b)在T态，二体紧密地堆积在一起并，且在两条β

链之间有直接的氢键，两条β链一条来自于A-B二体(蓝色)，另一条来自于C-D二体(绿色)，氢键以黄色表示。(c)在R态，二体被分开在两条β链之间形成了一个裂缝，缝内由水分子所充满(红色)这些水分子在二体之间形成氢键水桥，把来自于两个二体的两条β

链连接起来。目前四十四页\总数一百一十二页\编于二十点磷酸果糖激酶活性部位的构象变化(a)在活性R态底物果糖-6-磷酸,F6P(红色)与小α

螺旋(橙色)上精氨酸残基Arg162形成盐桥，此盐桥启动底物与酶的结合。(b)在非活性的T态，螺旋被部分地解旋并改变了取向。Arg162远离底物的结合部位，一个负电荷的谷氨酸残基Glu161指向底物分子的磷酸结合部位，Glu161的负电荷与F6P磷酸基团之间的斥力阻止了结合导致了亲和力。与活性R态相比下降了数千倍。目前四十五页\总数一百一十二页\编于二十点Monod的理论：四聚体的酶以平衡的形式存在于催化活性的R态和非活性的T态之间。在这两种态中亚基的三级结构有差异，与分子的四级结构的差异也密切相关。底物F6P偏好地与R态结合因此将此平衡向位移到R态，由于一致性的机理，一个F6P与第一个亚基的结合提供了使另外三个亚基向R态的平衡，因此具有了F6P结合和催化的协同性。ATP与两种态都可结合，所以不会使平衡产生位移，因此也就没有ATP结合的协同性。抑制剂PEP偏好地与T态形式的分子的效应子结合部位结合，结果平衡被推向非活性的一边；相反激活子ADP偏好地与R态形式的效应子结合部位结合，导致平衡被推向活性的R态一边。目前四十六页\总数一百一十二页\编于二十点1酶由四个相同的亚基组成，每个亚基有一个与配基的结合位点2亚基能够打开和关闭两个处于平衡的固有的构象态R态和T态3在每个四体分子中的这些态之间的转换是一致的，即每个分子中的四个亚基处于相同的状态或者R态或者T态4两态对ATP有着相同的亲和性，但对底物F6P别构效应子ADP和抑制剂PEP的亲和性则不同，由于这些亲和性的差异，配基结合能够使R态和T态之间平衡产生位移，朝哪个方向位移取决于与什么样的配基结合。作业：磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase,PFK)和底物复合物的结构并阐明其功能目前四十七页\总数一百一十二页\编于二十点血红蛋白的结构与功能1,Somefundamentalconcepts2,thestructureandfunctionofmyoglobinandhemoglobin目前四十八页\总数一百一十二页\编于二十点Amoleculeboundreversiblybyaproteiniscalledaligand.Aligandmaybeanykindofmolecule,includinganotherprotein.Aligandbindsatasiteontheproteincalledthebindingsite,whichiscomplementarytotheligandinsize,shape,charge,andhydrophobicorhydrophiliccharacter.Themoleculesacteduponbyenzymesarecalledreactionsubstratesratherthanligands,andtheligand-bindingsiteiscalledcatalyticsiteoractivesiteThebindingofaproteinandligandisoftencoupledtoaconformationalchangeintheproteinthatmakesthebindingsitemorecomplementarytotheligand,permittingtighterbinding.Thestructuraladaptationthatoccursbetweenproteinandligandiscalledinduced(诱导契合）.目前四十九页\总数一百一十二页\编于二十点KahasunitsofM-1,ahighervalueofKacorrespondstoahigheraffinityoftheLigandfortheprotein目前五十页\总数一百一十二页\编于二十点目前五十一页\总数一百一十二页\编于二十点目前五十二页\总数一百一十二页\编于二十点Kdisequivalenttothemolarconcentrationofligandatwhichhalfoftheavailableligandbindingsitesareoccupied.Theproteinissaidtohavereachedhalf-saturationwithrespecttoligandbiending目前五十三页\总数一百一十二页\编于二十点目前五十四页\总数一百一十二页\编于二十点Thefamilyofglobin(珠蛋白):肌红蛋白:myoglobin-oxygenstorageprotein血红蛋白:hemoglobin-oxygentransportprotein

(twocopiesofeachαglobinandβglobinincomplexwith4hemes)目前五十五页\总数一百一十二页\编于二十点Roleoftheglobinsinoxygentransportandstorage.hemoglobinmyoglobin目前五十六页\总数一百一十二页\编于二十点Heme(血红素）目前五十七页\总数一百一十二页\编于二十点ThestructuresofporphyrinsHemeisfoundinanumberofoxygen-transportingproteins,suchastheCytochromesthatparticipateinoxidation-reductionreaction目前五十八页\总数一百一十二页\编于二十点Myoglobin目前五十九页\总数一百一十二页\编于二十点ThestructureofmyoglobinMyoglobin(Mr16,700)isasinglepolypeptideof153aminoacideresidueswithonemoleculeofheme.Thepolypeptideismadeupof8αhelicalsegmentsconnectedbyBends.About78%oftheaminoacideresiduesarefoundintheseαhelices.8αhelicalsegmentsarenamedA-HHis93(HisF8)coordinatedtotheHemegroupThebendsaredesignatedAB,CD,EF,FGThehemeisboundinapocketmadeupLargelyofEandFhelices,althoughAminoresiduesfromothersegmentsofTheproeinalsoparticipate目前六十页\总数一百一十二页\编于二十点目前六十一页\总数一百一十二页\编于二十点Thestructureofmyoglobin目前六十二页\总数一百一十二页\编于二十点目前六十三页\总数一百一十二页\编于二十点Thestructureofmyoglobin目前六十四页\总数一百一十二页\编于二十点OxygenbindstohemewiththeO2axisatanangle,abindingconformationreadilyaccommodatedbymyoglobin.(b)CarbonmonoxidebindstofreehemewiththeCOaxisperpendiculartotheplaneoftheporphyrinring.Whenbindingtothehemeinmyoglobin,COisforcedtoadoptaslightanglebecausetheperpendiculararrangementisstericallyblockedbyHisE7,thedistalHis.ThiseffectweakensthebindingofCOtomyoglobin.(c)Anotherview(derivedfromPDBID1MBO),showingthearrangementofkeyaminoacidresiduesaroundthehemeofmyoglobin.TheboundO2ishydrogen-bondedtothedistalHis,HisE7(His64),furtherfacilitatingthebindingofO2.目前六十五页\总数一百一十二页\编于二十点DynamicsofoxygenreleasebymyoglobinThebendingofO2tothehemeinmyoglobindependsonmolecularmotion,or“breath”inproteinstructure.OnemajorrouteisprovidedByrotationofthesidechainofdistalHis(His64).Therate-limitingprocessinoxygenreleaseistheopeningofapathwayfortheO2moleculetoescapefromthehemepocket.Oxygenmayspendtime"rattlinginitscage"-andperhapsbeingrecaptured-beforethetertiarystructureofthemyoglobinshiftsenoughtoletitescape

目前六十六页\总数一百一十二页\编于二十点HemoglobinHemoglobin(Mr64,500)isatetramericproteinContainingfourhemegroups,oneassociatedwitheachpolypeptidechain.AdulthemoglobincontainsTwotypesofglobin,twocchains(141residues)andtwoβchains(146residues).Fewerthanhalfoftheaminoacideresiduesin