基因治疗生物化学

一、基因治疗的类型(lèixíng)1.基因调控治疗从基因水平调控缺陷基因表达，改善病症镰型细胞(xìbāo)贫血症---用5-氮胞苷抑制甲基化酶，使因甲基化而关闭的γ基因重新开放，产生HbF代替HbA用反义RNA抑制基因表达核酶〔ribozyme〕切割RNA阻断基因表达肿瘤治疗，在基因水平抑制肿瘤细胞(xìbāo)基因恶性表达和引导肿瘤细胞(xìbāo)逆转。第一页，共34页。1基因治疗的类型(lèixíng)〔续〕2.基因矫正治疗基因增补—正常基因导入患者(huànzhě)体内补偿缺陷基因功能基因替换—以正常基因取代变异基因基因校正—体外对异常基因进行纠正。第二页，共34页。2基因治疗的类型(lèixíng)〔续〕按矫正基因的类型分为两种基因治疗：

·生殖细胞基因治疗—对生殖细胞或早期胚胎细胞进行基因矫正。

·体细胞基因治疗—以体细胞为受体细胞，不影响下一代常用细胞介导法：选择靶细胞在体外进行基因修饰，再将其输入(shūrù)体内。第三页，共34页。3基因(jīyīn)置换〔genereplacement〕

定义：将特定目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常(zhèngcháng)基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。

目的：将缺陷基因的异常序列(xùliè)进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。第四页，共34页。4定向整合的条件:转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行局部基因序列的交换。基因同源重组技术(jìshù)又称为基因打靶(genetargeting〕细胞内基因同源重组的发生率很低。基因同源(tónɡyuán)重组技术第五页，共34页。5基因(jīyīn)增补〔geneaugmentation〕定义:通过(tōngguò)导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型:有缺陷基因细胞中导入正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物到达治疗疾病(jíbìng)的目的。第六页，共34页。6基因干预〔geneinterference〕基因失活定义：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以到达治疗(zhìliáo)疾病的目的。第七页，共34页。7〔一〕反义RNA〔antisenseRNA〕

1.反义RNA与基因表达调控利用(lìyòng)反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：〔1〕体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。〔2〕构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。第八页，共34页。8反义RNA技转移(zhuǎnyí)术①受体介导的RNA转移十分(shífēn)专一，而且效率高；②被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层,可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。借助前述的受体介导基因(jīyīn)转移方法，可以实现受体介导的反义RNA转移。第九页，共34页。9反义RNA的优点(yōudiǎn)受体介导的反义RNA基因治疗(zhìliáo)有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗(zhìliáo)的缺乏。

〔l〕平安(píngān)性高〔2〕反义RNA设计和制备方便

〔3〕具有剂量调节效应

〔4〕能直接作用于一些RNA病毒第十页，共34页。10核酶(ribozyme)

天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作用(zuòyòng)。但核酶也可以由两个RNA分子组成。在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，将靶RNA分子切断(qiēduàn)，通过破坏靶RNA分子而到达治疗疾病的目的。第十一页，共34页。11核酶锤头状的二级、三级结构(jiégòu)只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构〔3个螺旋区〕，并能组成核酶的核心序列〔13个或11个保守(bǎoshǒu)核苷酸序列〕，就可在锤头右上方产生剪切反响。目录第十二页，共34页。12核酶是通过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面(fāngmiàn)来设计核酶。

〔1〕选择适宜的靶部位，该部位具有核酶切割(qiēgē)位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。〔2〕核酶的根本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个局部组成，中间是保守序列〔能够(nénggòu)组成酶活性结构域〕，两端是引导序列。第十三页，共34页。13干扰(gānrǎo)RNA

RNA干扰〔RNAinterference，RNAi〕是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA〔mRNA〕被降解，从而抑制该基因的表达。有义RNA〔senseRNA〕或反义RNA〔antisenseRNA〕均能抑制线虫基因的表达，双链RNA比单链RNA更为有效。这与传统上对反义RNA技术的解释(jiěshì)正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。

第十四页，共34页。14

RNA干扰过程(guòchéng)主要有2个步骤：

〔1〕小干扰(gānrǎo)性RNA〔siRNA〕〔2〕siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导(yòudǎo)的沉默复合体〔RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。第十五页，共34页。15研究(yánjiū)基因功能的新工具

由于RNA干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为(zuòwéi)功能基因组学的一种强有力的研究工具。

RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因(jīyīn)的表达，建立多种表型；抑制基因(jīyīn)表达的时间可以控制在发育的任何阶段。

第十六页，共34页。161.体外化学合成;2.用质粒载体(zàitǐ)或病毒载体(zàitǐ)可在细胞内稳定地生成。siRNA的产生(chǎnshēng)第十七页，共34页。17定义：将“自杀〞基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀〞效应，从而到达去除肿瘤(zhǒngliú)细胞的目的。应用：是恶性肿瘤(zhǒngliú)基因治疗的主要方法。〔四〕自杀(zìshā)基因治疗(SuicideGeneTherapy)第十八页，共34页。18〔五〕基因(jīyīn)免疫调节通过将抗癌免疫(miǎnyì)增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫(miǎnyì)反响。第十九页，共34页。19二、基因治疗的条件(tiáojiàn)·对导入的基因及其产物(chǎnwù)有详尽了解；

·外源基因有效导入受体细胞、稳定整合、适量表达；

·不影响受治细胞基因组及表达调控；

导入基因方法平安，载体对靶细胞无害；第二十页，共34页。20三、基因治疗的原那么(nàme)对象是病情严重、预后差、别无他法的患者转移的基因被克隆无需高水平表达(biǎodá)和精确定量控制就有治疗效果靶细胞获取或回输平安转移基因表达(biǎodá)对细胞微环境无严格特异性要求第二十一页，共34页。21四、基因疗法(liáofǎ)的步骤目的〔治疗〕基因的选择根据基因治疗类型选择相应目的基因〔增补、替换、添加〕基因载体的构建使目的基因在受体细胞内高效、可控、稳定地表达(biǎodá)受体细胞选择易别离获取，体外增殖存活，大量扩增。如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞第二十二页，共34页。22基因(jīyīn)转移(genetransfer)方法

第二十三页，共34页。23

病毒(bìngdú)载体介导基因转移效率较高据统计，有72%的临床实验方案和71%的病例使用了病毒(bìngdú)载体，其中用得最多的是反转录病毒(bìngdú)载体。第二十四页，共34页。24反转录病毒的结构(jiégòu)及生活周期〔1〕反转录(zhuǎnlù)病毒第二十五页，共34页。25〔2〕腺病毒(adenovirus)载体

通过受体介导的内吞作用进入细胞(xìbāo)内，然后腺病毒基因组转移至细胞(xìbāo)核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞(xìbāo)基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，尚未发现与肿瘤发生有关联。第二十六页，共34页。26常用(chánɡyònɡ)基因治疗载体

整合致病性感染细胞克隆容量反转录病毒载体随机整合，效率高可能致病分裂细胞<7kb腺病毒载体不整合，可能丢失不致病分裂细胞、非分裂细胞

腺相关病毒载体定点整合(19号染色体特定区域)不致病分裂细胞、非分裂细胞<5kb第二十七页，共34页。272.非病毒载体介导的基因(jīyīn)转移系统

〔1〕脂质体介导的基因(jīyīn)转移技术使用方便、本钱低廉。根本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA〔即目的基因(jīyīn)〕转移至细胞内，并进行表达。第二十八页，共34页。28〔2〕受体介导转移(zhuǎnyí)技术

将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子〔如多聚赖氨酸〕来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露(bàolù)于外表。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。第二十九页，共34页。29〔3〕基因直接注射技术不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验说明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。

将促进(cùjìn)心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%；将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ。第三十页，共34页。30基因(jīyīn)直接注射法的优点制备具有(jùyǒu)调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；导入的基因不需整合即可表达，防止了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；基因直接注射法可反复使用，而病毒载体那么可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。第三十一页，共34页。31五、基因治疗的应用(yìngyòng)治疗恶性肿瘤治疗黑色素瘤--将已导入IL2基因的TIL细胞回输给病人(bìngrén)，启动自身免疫治疗艾滋病--用射线照射已导入HIV基因的成纤维细胞，细胞停止分化，但能产生gp160，将细胞回输给病人(bìngrén)，能激活免疫系统，杀伤HIV感染细胞。治疗家族性高胆固醇血症〔FH〕肝细胞低密度脂蛋白〔LDL〕受体基因混乱造成，将LDL基因导入病人(bìngrén)离体培养的肝细胞，然后经导管注入门脉循环，进入肝细胞后表达相应功能蛋白。