核算杂交技术,聚合酶链反应

概述分子生物学的重要方法之一使用特定标记的已知核酸序列与待测核酸进行特异性的杂交结合，形成杂交体，并利用相应的显示技术来检测目标核酸的存在及其位置的分子生物学方法目前一页\总数一百页\编于十四点基本原理目前二页\总数一百页\编于十四点核酸由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸，简称RNA；和脱氧核糖核酸，简称DNA。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，其中转移核糖核酸，简称tRNA，起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mRNA，是合成蛋白质的模板；核糖体的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。目前三页\总数一百页\编于十四点核酸的结构与特征核酸的结构一级结构：核苷酸以3’，5’磷酸二酯键构成无分支结构的线性分子二级结构：双螺旋结构或局部双链三级结构：超螺旋结构四级结构：DNA与蛋白质形成复合物目前四页\总数一百页\编于十四点核算的结构与特征核酸的特性核酸的变性作用爆发式Tm值核酸的复性作用骤然冷却缓慢冷却目前五页\总数一百页\编于十四点核酸的杂交在适宜的条件下，将不同来源的DNA放在试管里，经热变形后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则可以通过互补碱基多之间非共价键（氢键）的作用，形成稳定的双链区，即复性形成杂交DNA探针（probe）：利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，通常把标记的分子叫探针探针技术与核酸分子杂交技术相结合目前六页\总数一百页\编于十四点目前七页\总数一百页\编于十四点核算杂交的方法固相杂交固相支持物应具备的特征：1、具有较强的结合核酸分子的能力2、与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应3、与核酸分子的结合稳定牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程而不至于脱落或脱落很少4、非特异性吸附少，在洗膜条件下能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉5、具有良好的机械性能固相杂交类型：Southern印记、Northern印记、组织原位杂交、菌落原位杂交等液相杂交目前八页\总数一百页\编于十四点核酸探针的制备目前九页\总数一百页\编于十四点概述核酸探针以研究和诊断为目的，用来检测特定序列核算的DNA或RNA片段。目前十页\总数一百页\编于十四点核酸探针的种类DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针优点缺点目前十一页\总数一百页\编于十四点核酸探针的标记和检测放射性标记

32P和35S切口移位法随机引物延伸标记法末端标记法125I标记RNA和DNA非放射性标记

生物素、洋地黄毒苷配体-dUTP、辣根过氧化物、碱化基团半抗原、荧光素、化学发光剂、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶间接标记法直接标记法DNA探针的吖啶酯标记目前十二页\总数一百页\编于十四点Southern印迹杂交目前十三页\总数一百页\编于十四点概述Southernblotting将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物上，即印迹固定于膜上的核酸同标记的探针在一定的温度和离子强度下退火（复性），即分子杂交过程目前十四页\总数一百页\编于十四点Southernblotting待测核算样品的制备与限制酶消化采集样本、提取DNA基因组DNA很长，通常用限制性酶消化目前十五页\总数一百页\编于十四点Southernblotting琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品目的：按片断长短进行分离，确定杂交靶分子的大小琼脂糖凝胶浓度的选择电泳，EB染色，紫外灯观察凝胶目前十六页\总数一百页\编于十四点Southernblotting电泳凝胶的预处理为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控制在大约2kb一下0.25mol/LHCl短暂脱嘌呤，碱液浸泡，使DNA变性病断裂形成较短的单链DNA片段，用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液，然后在20×SSC中平衡凝胶10min目前十七页\总数一百页\编于十四点Southernblotting转膜常用固相支持物：NC膜和Nylon膜常用转膜方法：细管虹吸印迹法、电转移法、真空转移法等目前十八页\总数一百页\编于十四点Southernblotting探针标记预杂交与Southern杂交将膜上所能与DNA结合的位点全部封闭，即预杂交的目的；预杂交后杂交2×SSC淋洗膜后置于合适的容器中并加入10ml左右的预杂交溶液，65℃转动或摇动3-4h；煮沸探针5-10min使其变性，立即加入65℃预热的杂交液；倒去预杂交液并加完成的杂交液，65℃转动或摇动过夜目前十九页\总数一百页\编于十四点Southernblotting洗膜采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交的关键一步放射性自显影检测X线底片曝光与洗片目前二十页\总数一百页\编于十四点Southernblotting注意事项目前二十一页\总数一百页\编于十四点Northern杂交技术目前二十二页\总数一百页\编于十四点实验原理：Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术。其基本原理和程序与Southern杂交类似，基本过程包括RNA的提取，琼脂糖凝胶电泳分离，将变性的RNA从凝胶向滤膜转移，然后与滤膜结合，最后用标记探针对固定在膜上的RNA进行杂交，用放射自显影等方法显示与标记探针序列互补的目的条带。目前二十三页\总数一百页\编于十四点由于RNA极易降解，而RNA酶不仅无处不在，而且很难消除，所以在操作过程中必须采取必要的措施，包括使用专门准备的用具、试剂和溶液等，所有溶液尽量用DEPC处理后高压消毒的高质量去离子水制备。由于手汗含有大量的RNA酶，因此操作人员必须戴防护手套。目前二十四页\总数一百页\编于十四点实验步骤：1、进行RNA琼脂糖凝胶电泳2、RNA变性3、将RNA转移到尼龙膜上4、使RNA与尼龙膜结合5、RNA与探针杂交6、洗去非结合探针7、放射自显影显示与标记探针序列互补的目的条带目前二十五页\总数一百页\编于十四点变性：由于RNA直接与尼龙膜结合力差，且具有茎环结构，必须将RNA先经变性剂（甲醛/羟甲基汞/戊二醛）处理，一方面使RNA变性，另一方面可促进RNA与滤膜有效结合。注意：RNA变性与DNA变性方法不同，不能用碱变性，否则易引起RNA水解。目前二十六页\总数一百页\编于十四点转移：用刀片修饰凝胶，弃去不需要部分和加样孔以上部分，并在一角切成三角形缺口以做记号。剪取一张略大的尼龙膜，一角剪成与凝胶缺口同样大小的三角形缺口，将膜漂浮在一盘去离子水表面，待完全侵湿后在10倍SSC中侵泡至少5min。转膜有两种方法：电转移法和毛细管转移法目前二十七页\总数一百页\编于十四点毛细管转移法图示：目前二十八页\总数一百页\编于十四点电转移法图示：目前二十九页\总数一百页\编于十四点取出尼龙膜，甩掉多余液体，将有RNA的一面朝上，在滤纸上晾几分钟。将尼龙膜晾干后，夹在两滤纸之间，在真空烘烤箱中80℃烘烤2h。目前三十页\总数一百页\编于十四点杂交将放射性同位素标记的DNA探针经100℃煮沸5min和冰浴2min变性，然后将探针和膜放入袋中杂交，在68℃水浴中杂交过夜。

目前三十一页\总数一百页\编于十四点杂交结束后，将尼龙膜在一定量的0.1%SDS-1倍SSC中室温下轻轻摇动洗涤10min，然后在一定量的预热至68℃的0.1%SDS-0.5倍SSC中洗涤3次。

目前三十二页\总数一百页\编于十四点注意事项：1、EB会影响RNA与尼龙膜的结合，所以在胶中不能加核酸染料EB。2、实验所用的器具、试剂以及实验环境一定要防止RNase的污染。3、所有用于Noethern印迹的溶液均需用DEPC处理后高压消毒的高质量去离子水制备。4、操作人员必须戴防护手套和口罩，防止RNase污染和操作人员吸入DEPC中毒。目前三十三页\总数一百页\编于十四点聚合酶链反应目前三十四页\总数一百页\编于十四点基因扩增（geneamplification)——指生物体内或体外基因拷贝数大规模增加。PCR扩增：应用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，在体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。基因扩增技术---PCR目前三十五页\总数一百页\编于十四点DNA的复制（1）3’-OH进攻5’-PiDNA聚合酶催化DNA的延伸方向:5‘->3’目前三十六页\总数一百页\编于十四点DNA的复制（2）DNA复制相关蛋白在复制起始点打开双链DNA然后DNA解链酶结合到单链DNA上进一步解开双链DNA目前三十七页\总数一百页\编于十四点DNA的复制（3）目前三十八页\总数一百页\编于十四点PCR技术的创建

KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。目前三十九页\总数一百页\编于十四点故事发生在1983年

的春夏之交目前四十页\总数一百页\编于十四点KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人员得

诺贝尔奖，Mullis是其中之一目前四十一页\总数一百页\编于十四点Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA……目前四十二页\总数一百页\编于十四点Mullis的第一个PCR实验

1983年9月中旬，Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。目前四十三页\总数一百页\编于十四点94℃55℃37℃目前四十四页\总数一百页\编于十四点基本原理PCR是一种体外酶促合成特异DNA片段的新方法它由一对引物介导，与模板DNA特异结合，选择性地扩增特异的DNA片段反应体系包括：DNA靶序列、引物、四种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、耐热DNA聚合酶、合适的缓冲液体系目前四十五页\总数一百页\编于十四点PCR技术的三步反应目前四十六页\总数一百页\编于十四点PCR循环--变性目前四十七页\总数一百页\编于十四点PCR循环--变性目前四十八页\总数一百页\编于十四点PCR循环--变性目前四十九页\总数一百页\编于十四点PCR循环—退火目前五十页\总数一百页\编于十四点PCR循环—延伸目前五十一页\总数一百页\编于十四点PCR循环—延伸目前五十二页\总数一百页\编于十四点PCR循环—延伸目前五十三页\总数一百页\编于十四点PCR循环—延伸目前五十四页\总数一百页\编于十四点PCR整个过程目前五十五页\总数一百页\编于十四点目前五十六页\总数一百页\编于十四点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃目前五十七页\总数一百页\编于十四点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物目前五十八页\总数一百页\编于十四点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶目前五十九页\总数一百页\编于十四点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点

第1轮结束第2轮开始95℃目前六十页\总数一百页\编于十四点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃TaqTaqTaqTaq目前六十一页\总数一百页\编于十四点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第2轮结束目前六十二页\总数一百页\编于十四点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增目前六十三页\总数一百页\编于十四点PCR的技术路线目前六十四页\总数一百页\编于十四点PCR的基本步骤体系（加样方法）10×PCR缓冲液10ulDNA模板0.1-1ugdNTP（2mmol/L）各10ul两种引物（10-50umol/L）各1-2ulddH2O（灭菌）加至100ul

离心15s，加石蜡目前六十五页\总数一百页\编于十四点PCR的基本步骤PCR循环预变性97℃，2-5min，迅速冷却至室温加入TaqDNA聚合酶主循环变性94℃30-60s退火55℃30-60s延伸72℃60-150s循环25-35次终延伸72℃5-10min目前六十六页\总数一百页\编于十四点目前六十七页\总数一百页\编于十四点PCR的反应体系及其优化目前六十八页\总数一百页\编于十四点概述模板引物缓冲体系一价或二价阳离子四种dNTP耐热DNA聚合酶目前六十九页\总数一百页\编于十四点模板模板的纯化模板DNA片段大小适宜的模板量目前七十页\总数一百页\编于十四点引物引物：决定PCR反应的特异性PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增目前七十一页\总数一百页\编于十四点基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。引物设计的原则目前七十二页\总数一百页\编于十四点引物引物的长度引物的扩增跨度引物的组成引物3‘端配对引物的浓度目前七十三页\总数一百页\编于十四点①引物长度：15-30bp，常用20bp左右—引物的有效长度不能大于38bp，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性②引物扩增跨度：以500bp为宜—特定条件下可扩增长至10kb的片段目前七十四页\总数一百页\编于十四点③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜—G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带—ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因为这样会使引物在G+C富集区引发错误延伸④避免引物内部出现二级结构和引物间互补—特别避免3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带目前七十五页\总数一百页\编于十四点目前七十六页\总数一百页\编于十四点⑤引物3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）—特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败⑥引物5′端可修饰—引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响

目前七十七页\总数一百页\编于十四点⑦引物的特异性：—引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性⑧引物量：—每条引物的浓度0.1~0.5μM，以最低引物量产生所需要的结果为好—引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会目前七十八页\总数一百页\编于十四点技术举例目前七十九页\总数一百页\编于十四点目前八十页\总数一百页\编于十四点目前八十一页\总数一百页\编于十四点目前八十二页\总数一百页\编于十四点目前八十三页\总数一百页\编于十四点目前八十四页\总数一百页\编于十四点目前八十五页\总数一百页\编于十四点目前八十六页\总数一百页\编于十四点目前八十七页\总数一百页\编于十四点目前八十八页\总数一百页\编于十四点耐热DNA聚合酶目前有两种TaqDNA聚合酶供应天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个典型的PCR反应约需酶量1-2.5U/100ul体系浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少目前八十九页\总数一百页\编于十四点TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的功能TaqDNA聚合酶的特性TaqDNA聚合酶的使用量TaqDNA聚合酶的影响因素目前九十页\总数一百页\编于十四点三磷酸脱氧核苷酸在PCR反应中，dNTP应为50～200μM，浓度过低会降低PCR产物的产量注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配高浓度的dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性目前九十一页\总数一百页\编于十四点二价阳离子Mg2+Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低T