四季草莓品种RAPD分析

吉林农业大学11份四季草莓品种RAPD分析论文题目学生姓名:专业年级:指导教师:学士学位论文11份四季草莓品种RAPD分析论文题目学生姓名:专业年级:指导教师:何新05级园艺教育王连君职称副教授二零零九年六月六日目录TOC\o"1-5"\h\z题目II摘要及关键词I1前言1\o"CurrentDocument"2材料与方法2\o"CurrentDocument"2.1材料2\o"CurrentDocument"2.1.1供试品种22.1.2实验试剂与仪器2\o"CurrentDocument"2.1.2.1实验试剂2\o"CurrentDocument"2.1.2.2实验仪器2\o"CurrentDocument"2.2方法2\o"CurrentDocument"2.2.1草莓DNA的提取2\o"CurrentDocument"2.2.2RAPD反应条件22.2.3扩增产物的检测方法32.2.4数据处理与分析3\o"CurrentDocument"3结果3\o"CurrentDocument"3.1基因组DNA检测3\o"CurrentDocument"3.2引物的筛选4\o"CurrentDocument"3.3PCR扩增4\o"CurrentDocument"3.4聚类分析5\o"CurrentDocument"4讨论与结论5\o"CurrentDocument"4.1讨论6\o"CurrentDocument"4.1.1基因组DNA的提取64.1.2遗传多样性的分析6\o"CurrentDocument"4.2结论6\o"CurrentDocument"参考文献7致谢8附录911份四季草莓品种RAPD分析学生：何新

专业：园艺教育

指导教师：王连君摘要：本实验在基于形态学基础上，选当前栽培较广的、适地性好的11个四季草莓，借助RAPD技术从分子水平对这些四季草莓进行了亲缘关系和起源的初步研究。通过对这11份草莓DNA进行RAPD分析计算得出，草莓基因组间的遗传距离范围在0.0947〜0.6092之间。从聚类图上，可以看出四季草莓的品种大体上可分为美洲与亚洲两个类群，进而分析了各品种间的亲缘关系，福建四季与大连四季为同物异名品种。可以为应用RAPD分子标记对草莓种资源进行分类及亲缘关系等方面的研究奠定了基础。关键词：四季草莓；RAPD标记；DNA多态性RAPDanalysisofseveralseasonsofstrawberryName:HeXinMajor:HorticultureEducationTutor:WangLianjunAbstract：Basedonthemorphologyoftheexperimentbasedonthecultivationofawiderselectionofcurrent,appropriateandgoodin11seasonsofstrawberries,usingRAPDtechnologyfromthemolecularleveloftheseseasonalstrawberriesweretheoriginofgeneticrelationshipandapreliminarystudy.11throughtheDNAforRAPDanalysisofstrawberrycalculated,strawberrygenomeofthegeneticdistancebetweentherangeofbetween0.0947~0.6092.Fromtheclustermap,wecanseethatfourvarietiesofstrawberriesingeneralcanbedividedintotwogroupsoftheAmericasandAsia,andthenanalyzedthegeneticrelationshipbetweenspeciescanbefortheuseofRAPDmolecularmarkersforclassificationofstrawberryspeciesandgeneticresources,therelationshipbetweenstudieslaidthefoundation.Keywords:FourSeasonsStrawberry;RAPDmarkers;DNApolymorphism1刖言草莓属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(FragariaL.),它是多年生草本植物，在园艺学上属于浆果类果树。其果实含有多种维生素，氨基酸，蛋白质，脂肪和矿物质等，营养丰富，口味鲜美，经济价值高［1］。根据光周期反应和结果期的不同，一般把草莓栽培品种分为3个不同类型，即短日的一季型(5-6月份结果)，长日的二季型和日中性连续结果型，其中连续结果型即四季草莓，它能全年多次开花结果［2］。目前关于日中性草莓，四季草莓的研究也越来越多。四季草莓(F.vescavar.semperflorens.)，是森林草莓的变种⑵，最早在原产阿尔卑斯山地区发现。邓明琴［3］在草莓志中记载了具有四季结果特性草莓类型，其中森林草莓有4个类型，绿色草莓有1个结果类型，卵形草莓多有四季结果特性，弗州草莓稀有四季结果性。由此可见，草莓四季结果特性的野生草莓类型还很多。我国的黑龙江3号草莓是野生的四季草莓"。目前，研究四季草莓及日中性草莓的遗传特性的学者［6］，对与北美和欧洲的较老的品种的四季结果习性来源尚不清楚，只知道日中性草莓的开花习性遗传来源于弗州草莓。四季草莓的四季结果习性机理比较复杂，即有抗寒的特性，又有四季开花结果的特性，控制抗寒基因与花期的基因都是多基因控制的［7,8］。我国在研究四季草莓生产开始的比较晚，起先在农户手中发现的，但没有受到重视。草莓是近十年内发展较为迅速的果树之一，草莓的倍性较复杂，分布较广，基因组杂合度高，在长期的自然演化和种间杂交过程中，形成生态适应性差异较大且数量庞大的一些变异的新种和新的无性系，以往的鉴定方法很难对它们进行准确的研究和分析，而分子标记技术克服了形态学方法的诸多缺点。分子标记又是草莓种质资源非原位收集以及野生草莓种质资源原位收集和保存的可靠工具［9,10］,尤其是RAPD技术，以其简单、快速、无同位素污染、多态性高和需DNA量少等优点，而被广泛的应用于农作物的种质鉴定和遗传多样性分析。本试验通过对几份四季草莓材料的分析，初步得出四季草莓间的亲缘关系，为草莓生产、育种服务。本实验在基于形态学基础上，选当前栽培较广的、适地性好的11个四季草莓，借助RAPD技术从分子水平对这些四季草莓进行了亲缘关系和起源的初步研究。可以为应用RAPD分子标记对草莓种资源进行分类及亲缘关系等方面的研究奠定了基础。2材料与方法2.1材料2.1.1供试品种材料采自吉林农业大学果树教学实习基地、公主岭国家寒地果树资源圃、北京林果所。计十一份供试草莓材料：1号福建四季、2号83-35、3号安娜、4号通化四季、5号大连四季、6号四季草莓、7号美国四季、8号卢比、9号加拿大四季、10号美德莱特、11号赛娃。2.1.2实验试剂和仪器2.1.2.1实验试剂TaqDNA聚合酶、10XPCRbuffer(含Mg2+)、10碱基随机引物、dNTPs、超纯水等扩增试剂；琼脂糖、DNA分子量标准(D2000Maker)、1XTAE缓冲液、载样缓冲液和核酸染料等电泳试剂。2.1.2.2实验仪器PCR扩增仪、DYY-6C型水平双稳电泳仪、电子天平、紫外透射仪、微波炉、冰箱、移液枪。2.2方法2.2.1草莓DNA的提取以草莓幼嫩叶片为材料，使用植物基因组试剂盒(plantGenomicDNAKit)提取。提取DNA溶解在灭菌水中，在-20°C条件下保存.用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。按实验条件稀释后，用于RAPD-PCR扩增反应。用于RAPD分析的引物为OPERON公司10碱基随机引物，购自北京鼎国生物技术有限责任公司。2.2.2RAPD反应条件PCR反应程序为：94C预变性4min，然后按程序：94C变性45s，37C退火45s，72C延伸120s，共进行35个循环，在72C延伸5min，于4C保存(^24小时)。RAPD反应体系如表1：表1：草莓RAPD反应体系Tablel:RAPDanalysissystemofstrawberry体系成分Systemcomposition工作液浓度Workingliquidconcentration加样量3lSamplevolume10xPCRBuffer（含Mg2书2.5dNTPs10mM0.5TaqDNA聚合酶1U1.0随机引物10pM1.0模板DNA20ng1.0双蒸水19.0总反应体积252.2.3扩增产物的检测方法取RAPD扩增产物6pl加3pl漠酚蓝，用1.5%琼脂糖凝胶（加入适量的核酸染料，100mlTAE加入却l核酸染料）电泳分离，电泳缓冲液为1XTAE。在DYY-6C水平双稳电泳仪上进行（稳压110V,200mA）电泳。约2小时［12.13］以后停止电泳，凝胶在紫外透射仪上观察，照相。2.2.4数据处理与分析选择材料中扩增出DNA多态性带的引物作为有效引物，其产物用作数据分析。采用将每一条带视为一个性状的原则，按凝胶同一位置上DNA带的有无进行统计，有带记做“1”，无带记做“0”。从获得的各材料的RAPD条带，转换成“0，1”矩阵后，借助Exce12000，DPSv3.01专业版软件对试验数据进行转换分析，使用Nei-Li遗传距离（Dice，1945；Nei和Li，1979）分析［11，⑵。采用最长距离法进行聚类分析，产生聚类图谱。其中，最长距离法的基本原理是：假设在某一分类运算循环过程中，被合并的类群是Gp和Gq，归并以后的新类群是Gr。Gi是任一已知的类群，Gr和Gi距离系数定义为：dri2=max（dpidqr）3结果3.1基因组DNA检测图1草莓基因组电泳检测结果Fig.1ElectrophoreticproductsofthegenomicDNAofstrawberry

M为markerDNA50ng从图1中可以得出，用试剂盒提取基因组DNA，胶孔干净没有杂质，主带清晰，DNA浓度在50-100ng/〃l。说明采用植物基因组试剂盒提取基因组DNA质量好，产率高，完全满足RAPD反应体系的要求。3.2引物的筛选利用5个随机引物对草莓的11个品种进行扩增，得到扩增条带数为41条带，每个引物扩增的DNA带数在5〜13条之间，平均每个引物扩增8.42条带，其中多态性带为36条，多态性达84.6%。5个引物扩增情况见表2：表25个RAPD引物在11份草莓品种上的扩增结果Table2:RAPDamplificationswith5primerson11strawberrycultivars引物编号No.ofprimer序列sequence5’-3’扩增带数/多态性数No.ofamplifiedbands/No.ofpolymorphism多态性所占的比例Percentageofpolymorphicbands(%)OPA-12TCGGCGATAG9/9100%OPA-14TCTGTGCTGG7/457%OPB-08GTCCACACGG12/12100%OPB-10CTGCTGGGAG6/466%OPZ-16TCCCCATCAC7/7100%总数41/3684.6%3.3PCR扩增从20个引物中筛选出5个扩增条带清晰，多态性好的引物用于草莓材料的正式扩增，利用这些引物能够对实验材料进行有效地区分.用筛选出的5个随机引物对11个草莓材料的基因组DNA进行RAPD扩增反应，扩增出的DNA谱带片段大小大多在500〜2000bp之间。引物对实验材料基因组DNA扩增结果如图2所示：图2：用引物OPB-10扩增的部分材料的RAPD产物图谱

Fig.2RAPDpatternamplifiedbyprimerOPB-10M为久DNA2000标准分子量参照物；3.4聚类分析使用Nei-Li遗传距离研究样本间亲疏程度的数量指标，是将每一个样品看成m维空间(m个变量)的一个点，在这m维空间中定义距离，距离较近的点归为同一类，距离较远的点归于不同的类。本实验对11份草莓DNA进行RAPD分析，计算得出草莓基因组间的遗传距离范围在0.0947〜0.6092之间。Nei&Li(Czekanowski(1913))相异系数见附录。图3四季草莓聚类图Fig.3DendrogramofFourSeasonsstrawberry从聚类图上看，阈值取0.49时，11份四季草莓被分为2类：第一类包括：卢比、加拿大四季、美德莱特、赛娃；第二类包括：福建四季、通化四季、大连四季、83-35、安娜、四季草莓。4讨论与结论4.1讨论4.1.1基因组DNA的提取对于分子标记技术来说，高质量的基因组DNA是分子标记成功的关键。植物体内所含的酚类、单宁、色素、多糖等物质如果在提取和纯化中未能去除干净会影响Taq酶的活性导致PCR扩增的失败［13］。草莓属植物的叶片多糖以及酚类物质较多，CTAB能有效裂解植物细胞和沉淀多糖［14］，本试验利用以草莓叶片为材料，使用试剂盒(plantGenomicDNAKit)法对草莓叶片的DNA提取效果很好。4.1.2遗传多样性的分析安娜与美德莱特、赛娃在遗传距离为0.37处，聚类到一起，而束靖［15］在研究草莓品种分类时研究的结果相似，但束靖［15］是在欧氏距为0.6处它们聚到一起，其原因还有待于进一步的研究。通化四季与大连四季带型基本一致，在引物OPZ16扩增的产物中，有两条明显不同的带，它们的遗传遗传距离很近，两份材料可能是同一品种，这个结论与邓明琴的研究结论一致。本实验从聚类图上可以看出，卢比、加拿大四季、美德莱特、赛娃它们的遗传距离比较近，在聚类图中聚在一起，他们都来自美洲。福建四季、通化四季、大连四季、83-35、安娜、四季草莓、美国四季它们的遗传距离比较近，在聚类图中聚在一起，他们大多数来自亚洲。四季草莓的品种大体上可分为美洲与亚洲两个类群。欧洲的四季草莓品种与较古老的北美草莓四季品种没有联系，但聚类图可以看到其中夹杂了几个欧洲品种，这可能是引种造成的。说明欧洲四季草莓品种与北美四季草莓品种虽说开花习性的遗传来源于弗州草莓，但北美和欧洲品系的四季习性来源尚不清楚，它们的遗传距离不是很近。卢比和加拿大四季品种聚在一起，但它们都与四季草莓品种聚在一起，并且都在美洲品种之中，其中的原因尚不清楚。束靖［15］在欧氏距离等于5.8时将品种分为四季草莓和中等日照草莓两类。4.2结论本实验通过对11份草莓DNA进行RAPD分析计算得出：①利用5个随机引物对草莓的11个品种进行扩增，得到扩增条带数为41条带，每个引物扩增的DNA带数在5〜13条之间，平均每个引物扩增8.42条带，其中多态性带为36条，多态性达84.6%。11份四季草莓基因组间的遗传距离范围在0.0947〜0.6092之间，当阈值为0.49时，四季草莓的品种大体上可分为美洲与亚洲两个类群。通化四季与大连四季的PCR扩增带基本一致，并且聚在一起，能为同物异名品种。可以为传统的分类方法提供补充，相互验证，特别在同名异种或异名同种的情况更有参考价值，为能更好的开发种质资源提供了一条更快速、可靠的新途径。参考文献晁无疾，钟新.秦巴山区野生草莓资源及其研究利用[J].作物品种资源，1998,(4):15〜18雷家军代汉萍，等.中国草莓属(Fragaria)植物的分类研究[J].园艺学报.2006,33(1):1〜5⑶邓明琴雷家军.中国果树志(草莓卷).北京:中国林业出版社,2005,4林凤起.长白山小浆果资源[J].作物品种资源,1986,(1):15〜17晁无疾钟新.秦巴山区野生草莓资源及其研究利用[J].作物品种资源,1998,(4):15〜18中国园艺学会草莓分会.草莓研究进展(一)[D].北京：中国农业出版社，2002,12：279〜283贾继增.分子标记种质资源鉴定和分子标记育种中国农业科学[J].1996,29(4)：1〜10ParanI.MiehelmoreR.W.DevelopmentofreliablePCRbasedmarlcerslinkedtodownymidewresistoncegenesinlettuce[J].TheoreticalandAppliedGenetics.1993,85:985^993MartelliG.SunseriF.GrecoetalStrawberrycultivarsgeneticrelationshipusingrandomlyampifiedpolymorphicDNA(RAPD)analysis[J].AdvancedinHorticulturalScience.1999.13:99^104白瑞霞彭建营等.DNA分子标记在果树遗传育种研究中的应用[J].西北植物学报2004.24(8)：1547〜1554王庆芬.抗寒梨种质资源RAPD的分子标记及其核心种质初步构建[M].长春：吉林农业大学,2007,5张艳艳张剑侠王跃进.中国野生葡萄抗霜霉病基因RAPD标记的筛选[J].果树学报，2008,25(6):816〜820DaleAandSjulinTM.Fewcytopla