重组DNA药物专题知识专家讲座

第七章重组DNA药品一、重组DNA技术与基因工程基本定义重组DNA技术是指将一个生物体（供体）基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一个生物体（受体）内，使之按照人们意愿稳定遗传并表示出新产物或新性状DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。所以，供体、受体、载体是重组DNA技术三大基本元件。重组DNA药物专题知识专家讲座第1页基因工程是指重组DNA技术产业化设计与应用，包含上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指是基因重组、克隆和表示设计与构建（即重组DNA技术）；而下游则包括到基因工程菌或细胞大规模培养以及基因产物分离纯化过程。重组DNA药物专题知识专家讲座第2页优点：1、可大量生产过去难以取得生理活性蛋白和多肽；去除内源性物质不足之处2、提供足够数量生理活性物质，以进行生理生化、结构研究3、利用基因工程技术可发觉、挖掘更多内源性生理活性物质4、取得新型化合物重组DNA药物专题知识专家讲座第3页主要基因工程产品研制、开发、上市时间产品人生长激素释放抑制素（SRM)人胰岛素首次克隆表示时间国家用途首次进入市场时间国家/地域1977日本治疗巨人症1978美国治疗糖尿病1982欧洲人生长激素（HGH)1979美国治疗侏儒症1985美国人α干扰素（α－IFN)1980美国治疗病毒感染症1985美国乙肝疫苗1983美国预防乙型肝炎1986欧洲人白细胞介素－21984日本治疗肿瘤1989欧洲人促红细胞生成素治疗贫血1988欧洲人粒细胞集落刺激因子治疗中性白细胞降低症1991美国人组织纤溶酶原激活剂（t-PA)治疗血栓症1987美国重组DNA药物专题知识专家讲座第4页DNA重组药品制造主要步骤取得目标基因DNA体外重组（切与连）载体选择受体细胞选择重组DNA分子转化（转）转化子筛选与判定（选）外源基因大规模表示和分离纯化产品检验和制剂制备重组DNA药物专题知识专家讲座第5页重组DNA药物专题知识专家讲座第6页二、基本过程上游阶段：试验室取得目标基因、酶切和酶连、插入适当载体、转入宿主细胞、复制、目标基因分析确证、表示、筛选适当表示系统等下游阶段：将试验室结果产业化发酵参数确定、新型生物反应器研制、高效分离介质及装置开发、生物传感器设计制造、电子计算机优化控制、产品质量控制注意：上游DNA重组设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；而下游过程则是上游基因重组蓝图表达和确保，这是基因工程产业化基本标准。重组DNA药物专题知识专家讲座第7页1、目标基因取得1）、鸟枪法（基因文库）基因组DNA提取→限制性内切酶部分水解→与载体连接→转化、扩增与筛选2）、逆转录法（cDNA文库）

mRNA纯化→cDNA第一合成→第二链合成→cDNA克隆→将重组体导入宿主细胞→cDNA文库判定→目标cDNA克隆分离和判定3）、合成法4）、PCR法重组DNA药物专题知识专家讲座第8页4、PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）

经典PCR反应包含①模板变性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（1～2′）③延伸72℃（1～2′）在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始从5′→3′延伸。重组DNA药物专题知识专家讲座第9页(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA扩增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互补链引物1互补链单位长度链不一样长度链5’3’3’5’引物1互补链引物2互补链目标片段（不一样长度链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)重组DNA药物专题知识专家讲座第10页5’3’3’5’靶DNA片段引物A5’5’引物A’3’3’PCRPCRPCR3’3’5’5’PCR引物B引物C5’5’3’3’混合,变性,退火5’3’5’3’3’5’3’5’+DNA聚合酶5’3’3’5’5’3’3’5’用引物B和C作PCRPCR定点诱变PCR用于基因突变重组DNA药物专题知识专家讲座第11页重组DNA药物专题知识专家讲座第12页重组DNA药物专题知识专家讲座第13页化学合成法

在已知DNA序列或多肽普通结构时，如链长在60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。重组DNA药物专题知识专家讲座第14页重组DNA药物专题知识专家讲座第15页2、基因表示1）、选择宿主细胞

原核

大肠杆菌：生长快；遗传研究深入；产品多为胞内（包含体）或周质中；不能糖基化修饰。需注意内毒素污染。

枯草芽孢杆菌：分泌力强，不形成包含体；不修饰；胞外酶可能会降解产物

链霉菌：分泌能力强；不致病，安全；有糖基化能力。重组DNA药物专题知识专家讲座第16页优点：易大量生产，成本低，周期短缺点：多为胞内表示、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性重组DNA药物专题知识专家讲座第17页真核酵母：研究基因表示调控最有效单细胞真核微生物；基因组小，仅为大肠杆菌4倍；传代时间短；无毒；有分泌功效和修饰功效；已用于干扰素、乙肝表面抗原等重组DNA药品生产。丝状真菌：有很强蛋白质分泌能力，能正确加工，糖基化方式与高等生物相同，有成熟发酵和后处理工艺哺乳动物细胞：类似天然产物，但培养条件苛刻重组DNA药物专题知识专家讲座第18页大肠杆菌与真核细胞表示系统比较大肠杆菌:

发酵包含体复性纯化目标蛋白真核细胞:发酵上清液纯化目标蛋白重组DNA药物专题知识专家讲座第19页大肠杆菌表示重组蛋白易形成包含体

高效表示目标蛋白在大肠杆菌内形成大量无活性包含体。因无法有效处理复性问题，在美国每年造成经济损失就达几十亿美元

包含体电镜图重组DNA药物专题知识专家讲座第20页蛋白质复性概念将蛋白质从结构不规则、无活性状态，恢复到有唯一立体结构、有生物活性状态过程称为蛋白质复性。重组DNA药物专题知识专家讲座第21页2）、表示载体要求：a、能独立复制b、有灵活多克隆位点和方便筛选标识c、含有有效运载外源基因能力，能携带大小不一样外源基因d、轻易控制，在细胞内稳定性高，安全可靠。重组DNA药物专题知识专家讲座第22页

如大肠杆菌pBV220系统，为温度诱导表示载体，已成功用于IL-2，IL-3，IFN等pET系统，最有潜力系统，可用乳糖代替IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖），产物可达细胞总蛋白20~30%，表示量可达总蛋白50%。重组DNA药物专题知识专家讲座第23页pET载体重组DNA药物专题知识专家讲座第24页

3）、构建工程菌目标基因与载体DNA连接重组DNA向宿主细胞内转移筛选与判定带有目标基因阳性克隆影响目标基因表示原因重组DNA药物专题知识专家讲座第25页三、重组药品分离纯化

A重组蛋白分离纯化方法选择基本标准◎针对不用产物表示形式采取不一样策略◎针对不一样性质重组蛋白选择不一样层析类型◎各种分离纯化技术联合利用◎适当分离纯化介质选择◎分离纯化过程规模化重组DNA药物专题知识专家讲座第26页◎针对不一样产物表示形式采取不一样策略采取分泌型战略表示重组蛋白，通常体积大、浓度低，所以应在纯化之前采取沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采取包涵体型战略表示重组蛋白，应先离心回收包涵体；采取融合型战略表示重组蛋白，普通是胞内可溶性，拟首先选取亲和层析进行纯化表示在细胞膜和细胞壁之间间隙中蛋白质，应用低浓度溶菌酶处理，然有再用渗透压休克法释放重组蛋白。重组DNA药物专题知识专家讲座第27页◎针对不一样性质重组蛋白选择不一样层析类型

等电点处于极端区域（大于8或小于5）重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这么很轻易除去几乎全部杂蛋白；重组蛋白特异性配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和层析纯化方法主要条件，标准是它们与目标蛋白之间解离常数应在适当范围内（10－8～10－4mol/L）;

疏水层析和反相层析是依据蛋白质疏水性差异进行分离；

凝胶过滤层析是依据蛋白分子量和体积差异进行分离；

径向层析是近年来发展起来集层析分离和膜分离于一体一个复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大优越性。重组DNA药物专题知识专家讲座第28页◎各种分离纯化技术联合利用在进行重组蛋白纯化时，通常需要综合使用各种技术，普通来说，在选择分离纯化方法时应遵照以下标准：＃应选择不一样分离纯化机理方法联合使用＃应首先选择能除去含量最多杂质方法＃应尽可能选择高效分离方法＃应将最费时、成本最高分离纯化方法安排在最终阶段重组DNA药物专题知识专家讲座第29页◎适当分离纯化介质选择惯用蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Sepharose。理想分离纯化介质应含有以下性质：＃对目标蛋白含有较高分辨效率＃对目标蛋白不会造成变性＃化学性能和机械性能稳定，重复性好＃价格低廉重组DNA药物专题知识专家讲座第30页◎分离纯化过程规模化蛋白质分离纯化试验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必适当，如：＃试验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）＃试验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）所以，在很多情况下，试验室技术路线不等于生产工艺。重组DNA药物专题知识专家讲座第31页四、质量控制

1、原材料质量控制：2、培养过程质量控制3、纯化工艺质量控制

4、目标产品质量控制

重组DNA药物专题知识专家讲座第32页确保编码DNA序列正确要了解以下特征：A、目标基因起源、克隆过程、序列B、表示载体名称、结构、遗传特征及酶切图谱、抗生素标识等C、宿主名称、起源、传代历史、检定结果及生物学特征D、载体引入宿主方式、及载体再宿主中状态E、插入基因于表示载体两侧控制区核酸序列F、开启和控制克隆基因表示方法及水平重组DNA药物专题知识专家讲座第33页种子克隆纯而且稳定，在培养工程中工程菌不应出现无突变或质粒丢失现象种子批系统工作细胞库重组DNA药物专题知识专家讲座第34页尽可能去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白等杂质，并防止在纯化过程带入有害物质纯化每一步应测定纯度、计算提纯倍数、收率等等重组DNA药物专题知识专家讲座第35页1）、产品判别氨基酸组成份析：肽图分析：N末端和C末端氨基酸测序：蛋白质二硫键分析：重组蛋白相对分子量：等电点测定：2）、纯度分析：SDS,CE,IEF,HPLC3）、生物活性测定4）、残余杂质检测宿主细胞蛋白含量、宿主细胞DNA、残余抗生素等5）、安全性检测无菌试验、热原试验、毒性试验、免疫原性检验重组DNA药物专题知识专家讲座第36页A

体内生物学活性测定方法生物学模型生长激素大鼠脑垂体B体外生物学活性测定方法如：MTT法:MTTformazan(蓝紫色)干扰素类蛋白：可用细胞毒抑制试验来测定干扰素体外活性。琥珀酸脱氢酶重组DNA药物专题知识专家讲座第37页五、主要重组DNA药品（一）利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽代表产品：重组人胰岛素、重组人生长激素、重组人干扰素、重组人白细胞介素、重组人集落刺激因子、重组抗体及其片断等。

效率高、产量大周期短、成本低工艺稳定、质量可控

缺点是易形成包含体重组DNA药物专题知识专家讲座第38页1）、干扰素（IFN-α、β、γ）1957年Isaccs等发觉病毒干扰现象，即病毒感染细胞能产生一个因子，作用于其它细胞干扰病毒复制，因而命名为干扰素。依据产生干扰素细胞起源、理化性质和生物活性等差异，可分为α、β、γ等3种，其中IFN-α为多基因产物，有23种以上亚型。重组DNA药物专题知识专家讲座第39页

1986年，FDA同意Roch企业重组IFN-α2a和Schering企业重组IFN-α2b，重组IFN-β、γ分别在1990年和1993年上市。我国中国预防医学科学院病毒学研究所侯云德等发觉中国人受病毒攻击产生干扰素主要为IFN-α1b型，1992年我国第一个基因工程药品IFN-α1b取得国家一类新药证书。重组DNA药物专题知识专家讲座第40页2）胰岛素(Insulin,Ins)1921年，BantingFG等从胰脏中分离1955年，SangerF测序1965年，我国完成结晶牛胰岛素全合成1979年，RutterW等克隆了胰岛素基因1982年，第一个重组人胰岛素同意上市重组DNA药物专题知识专家讲座第41页胰岛素结构及生物合成胰岛素原与胰岛素人胰岛素生产方法产人胰岛素大肠杆菌工程菌构建策略

重组DNA药物专题知识专家讲座第42页重组DNA药物专题知识专家讲座第43页(a)AB链分别表示法

体外折叠成功率低，通常只有10～20％(b)人胰岛素原表示法

因为C肽存在，胰岛素原在复性条件下能形整天然空间构象，为三对二硫键正确配对提供了良好条件，使得体外折叠率高达80％以上当前ElyLily用这种工艺路线年产几十吨重组人胰岛素，其经济效益相当可观。(c)AB链同时表示法重组DNA药物专题知识专家讲座第44页重组DNA药物专题知识专家讲座第45页重组DNA药物专题知识专家讲座第46页3）生长激素1944年，李卓浩等从牛垂体中分离出牛生长激素1956年，从人垂体中分离出hGH1969年，hGH序列报道临床上用于垂体性侏儒症。1956~1985年，只能从人尸体垂体中分离纯化。但至1985年，共发觉50多例克-雅氏症，5人病亡，研究结果证实由垂体起源生长激素污染有朊病毒。1985年，垂体起源被禁用，同年，rhGH上市。重组DNA药物专题知识专家讲座第47页1985年，美国FDA同意由大肠杆菌发酵生产重组人生长激素上市，随即各种路径生产重组人生长激素快速充满市场。1997年，仅美国Genentech和ElyLily两家企业重组人生长激素年产量已达20kg，年销售额超出3.5亿美元。人生长激素结构与性质重组人生长激素工程菌构建重组DNA药物专题知识专家讲座第48页重组DNA药物专题知识专家讲座第49页（二）利用重组酵母生产医用蛋白优势：1.最简单真核生物，基因表示调控机理较清楚，而且遗传操作相对较为简单；2.含有原核无法比拟真核生物蛋白翻译后修饰加工系统3.不含有特异性病毒，不产生毒素，有些酵母菌在食品工业当中有着几百年应用历史，属于安全型基因工程受体系统；4.大规模发酵工艺简单，成本低廉5.能将外源基因表示产物分泌至培养基中劣势：即使拥有完整蛋白质糖基化修饰系统，但其修饰方式不用于高等真核生物。举例：重组乙肝疫苗重组人血清白蛋白重组DNA药物专题知识专家讲座第50页重组HAS制备人血清白蛋白HAS是血浆中主要成份载体蛋白。成熟人血清白蛋白为一非糖基化单一多肽链，由585个氨基酸组成，含有17对二硫键，由此维系空间构象是血清白蛋白生物功效所必需。巴斯德毕赤酵母是迄今为止最为优良重组人血清白蛋白表示分泌系统。产率可高达15g/L

重组DNA药物专题知识专家讲座第51页（三）利用转基因动物或细胞生产生物大分子1.利用动物乳腺组织生产蛋白药品酪蛋白、tPA、IL－22.利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产复杂人体蛋白比如EPO重组DNA药物专题知识专家讲座第52页促红细胞生成素（EPO）由肾脏分泌一个唾液酸蛋白，它能促进红细胞系增值、分化和成熟.由166个氨基酸残基组成高度糖基化蛋白，其糖基对其生物活性至关主要当前用哺乳动物细胞表示系统如CHO细胞生产。临床为治疗肾衰造成贫血