遗传重组专业知识专家讲座

第八章遗传重组Recombination遗传物质发生变异主要有两方面原因：突变和重组重组———染色体序列发生重排和新组合，是遗传灵魂！遗传重组专业知识专家讲座第1页遗传重组遗传重组：造成基因型改变基因交流过程。发生：减数分裂性细胞内，体细胞地点：核基因间，叶绿体基因间，线粒体基因间，重组子间；前提条件：不一样基因型遗传物质彼此能够转移。作用：确保了遗传多样性,为选择奠定了物质基础,是生物得以进化发展，与突变一起是变异起源遗传重组专业知识专家讲座第2页遗传重组主要类型：(依据对DNA序列和所需蛋白质因子要求)同源重组位点专一性重组异常重组其共同点是双股DNA间物质交换，但发生情况不一样。遗传重组专业知识专家讲座第3页第一节遗传重组类型遗传重组或称基因重组是遗传基本现象。不论高等真核生物，还是细菌、病毒都存在遗传重组现象；遗传重组不但发生于代与代之间，即在减数分裂中发生基因重组，一个个体基因组也能够发生重排，即在体细胞中也会发生重组，这能产生基因表示改变，在一个个体细胞之间产生遗传基因多样性；另外，重组不只是在核基因之间发生，在叶绿体基因间、线粒体基因间也可发生重组；重组也见于噬菌体整合过程和转座子转座等过程中。由此可见，只要有DNA就会发生重组，这表明重组对物种生存是十分主要。遗传重组专业知识专家讲座第4页一、同源重组/普遍性重组

1.同源重组：依赖大范围DNA同源序列联会，重组过程中，两个染色体或DNA分子交换对等部分。例：同源染色体非姐妹单体交换；细菌转化、转导、结合；噬菌体重组…需要重组蛋白质参加；（比如.大肠杆菌：RecA蛋白、RecBC蛋白）蛋白质因子对DNA碱基序列特异性要求不高；（存在重组热点和序列长度影响）真核生物染色质状态影响重组频率。遗传重组专业知识专家讲座第5页1.进行同源重组条件（1）在交换区有相同或相同序列同源染色体相同区域DNA序列普通相同。同源区越长越有利于重组，大肠杆菌活体重组要求20－40bp相同；大肠杆菌与噬菌体或质粒重组同源区要求≥13bp;等p197遗传重组专业知识专家讲座第6页（3）重组酶使参加重组DNA发生断裂、重接、修复、重组体释放。（2）碱基配对参加重组DNA相互配对，形成异源双链。遗传重组专业知识专家讲座第7页3.功效：

A：维持种群遗传多样性；

B：有利于DNA损伤修复；

C：使真核生物产生第一次减数分裂中染色体正确分离到子细胞至关主要瞬间物理连接。遗传重组专业知识专家讲座第8页

二、位点专一性重组/保守性重组

原核生物中最为经典

特点：供体与受体特定位点短同源序列之间。DNA准确切割连接DNA不失去、不合成、不交换对等部分（有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子中，又称整合式重组），需要位点专一性蛋白质因子参加。遗传重组专业知识专家讲座第9页比如：λ噬菌体DNA经过其attP位点和大肠杆菌DNAattB位点之间专一性重组而实现整合过程。条件：一段15bp同源序列和位点专一性蛋白质因子（不能催化其它任何两条不论是同源还是非同源序列间重组，从而确保了λ噬菌体整合方式专一性和高度保守性，所以又称保守性重组。）而且这一重组不需要RecA蛋白质参加。遗传重组专业知识专家讲座第10页三、异常重组完全不依赖于序列间同源性而使一段DNA序列插入另一段中，但在形成重组分子时往往依赖DNA复制而完成重组过程，所以又称复制性重组。P198特殊例子：转座遗传重组专业知识专家讲座第11页第二节同源重组分子机制一、断裂重接模型（breakagejoiningmodel）C．D．Darlington1936年提出。在同源染色体联会时，因为染色体缠绕而产生张力，两个相对染色单体在同一位置断裂，然后彼此和另一染色单体重新连接起来从而形成重组并消除这种张力。遗传重组专业知识专家讲座第12页一异源DNA分子断裂与重接在细胞水平下，同源染色体配对、两条非同源染色体之间发生断裂、重组、交换。同源重组是参加重组DNA分子断裂与链接遗传重组专业知识专家讲座第13页二、异源DNA分子断裂与重接

1.证据：1961，M.MeselsonandJ.J.Wergle两个双标识λ噬菌体感染大肠杆菌。(c.mi)λ噬菌体1

13C和14N“重”链

(+.+)λ噬菌体2

12C和14N“轻”链同时感染大肠杆菌子代噬菌体CsCl密度梯度离心重链重链和轻链轻链遗传重组专业知识专家讲座第14页遗传重组专业知识专家讲座第15页2、几个概念：

重组关键：两个DNA分子连接

连接分子/接合分子：

重组接点/重组结合点：

杂种DNA/异源双链DNA：

分支迁移：重组接点沿双链移动

交互重组：一条亲本双螺旋分子和另外一条亲本双螺旋分子共价连接，中间有一端异源双链区，这种重组称为交互重组。

遗传重组专业知识专家讲座第16页三、同源重组Hollidaymodel1964年美国学者RobinHolliday提出了著名Holliday重组模型。前提：参加重组DNA靠近（同源染色体联会）1、同源重组Hollidaymodel遗传重组专业知识专家讲座第17页①参加重组两条DNA单链被切断②切开3’端与另一条链5’端交叉相连接遗传重组专业知识专家讲座第18页③交叉点移动，形成异源双链区④断裂在交叉点处四条单链DNA都断裂。遗传重组专业知识专家讲座第19页⑤重接以两种不一样连接方式重接。原地重接交换重接遗传重组专业知识专家讲座第20页⑥结果参加交换单链DNA中部都有异源区段（heteroduplex）（B’/b’）。两侧标识基因C/c有二分之一交换（c/c’；C/C’）遗传重组专业知识专家讲座第21页2该模型对重组过程解释以下：A、同源非姐妹染色单体联会；B：同源非姐妹染色单体DNA中两个方向相同单链，在DNA内切酶作用下，在相同位置同时切开；C：切开单链交换重接;D：形成交联桥结构；遗传重组专业知识专家讲座第22页E：交联桥沿配对DNA分子“移动”。两个亲本DNA分子间造成一大段异源双链DNA（Holliday结构）F：E和F相同；G：绕交联桥旋转1800；J：形成Holliday异构体；I、经过两种方式之一切断DNA单链，若左右切，则形成非重组体，若上下切则形成重组体。由上可知：不论Holliday结构断裂是否造成旁侧遗传标识重组，他们都含有一个异源双链DNA区。遗传重组专业知识专家讲座第23页HOLLIDAY模型遗传重组专业知识专家讲座第24页

遗传重组专业知识专家讲座第25页3环状DNA分子重组两个环状DNA分子配对、断裂、重接形成“8”字型结构中间物，依据切割位置不一样，可分别形成两个亲本环、大单体环或者是滚环结构。也能够形成“χ”结构。遗传重组专业知识专家讲座第26页2遗传重组专业知识专家讲座第27页遗传重组专业知识专家讲座第28页3、修改Hollidaymodel①前三步相同，②第四步时候先形成一个十字架结构（isomericHollidaystructure）遗传重组专业知识专家讲座第29页③十字架分离（断裂-重接）有两种方式④结果依然产生二分之一重组遗传重组专业知识专家讲座第30页十字架剪切只需两条链断开遗传重组专业知识专家讲座第31页Holliday十字架连接体电镜照片遗传重组专业知识专家讲座第32页4、双链断裂起始重组模型Double-StrandBreaksinDNAInitiateRecombinationSzostak等1983年提出，重组是由一系列内切酶和外切酶发动。内切酶与外切酶共同在一对DNA单链上制造一个缺口。利用另一条同源染色体DNA链为模板进行复制修复。遗传重组专业知识专家讲座第33页遗传重组专业知识专家讲座第34页遗传重组专业知识专家讲座第35页三、基因转变及其分子机理

重组是一个非常正确交互过程，在减数分裂产物中大多数是交互正常分离，但从大量分析知道，有时也会出现不规则情况，从而产生少许异常分离（abnormalsegregations）。对于任何重组模型不但必须说明正常重组过程，还必须考虑到这些不规则现象，所以我们在讨论重组分子基础以前，先说明一下重组模型应该兼顾到基因转变现象。遗传重组专业知识专家讲座第36页（一）异常分离与基因转变

在一个杂合体中，假如一染色体把基因A交给它同源染色体，则它同源染色体必定把基因a交回给它，所以在真菌中，一个座位上两等位基因分离时，应该展现2：2或1：1：1：1或1：2：1分离(表8-1)，这就说明重组通常总是交互。可是Lindegren在面包酵母（Saccharomycescerevisiae）中发觉，有子囊含有（3A+1a）或（1A＋3a）子囊孢子。以后在脉孢霉、酿酒酵母、子囊菌Ascobolusimmersus及果蝇中也发觉这种现象。8遗传重组专业知识专家讲座第37页Mitchell对子囊菌中出现异常分离现象进行了详细分析。在Mitchell杂交试验中，所用基因是关于吡哆醇（pyridoxine,维生素B6）合成。带有这个基因突变株需要在培养基上添加吡哆醇后才能生长，且对酸度（pH）敏感，改变酸度后，就无需添加了，这突变基因称作pdxp。在其非常邻近位点上另一突变基因pdx，也是吡哆醇需要型突变，但对酸度不敏感。遗传重组专业知识专家讲座第38页Mitchell把两个脉孢霉(N.crassa)吡哆醇突变株杂交，＋pdxp′pdx＋，取得子一代子囊后，对585个子囊中孢子依次解剖出来进行培养和判定。他发觉4个子囊中，有野生型孢子对(++)，好象这两个位点间有了重组；可是跟预期相反，重组后应该同时出现双突变型(pdxpdxp)孢子对却没有发觉(表9-2)。分析方法是灵敏，假如有双突变型话，是能够检出，而且也不可能是突变，因为它们出现频率比这些位点正常突变率高很多。55遗传重组专业知识专家讲座第39页在正常情况下，因为重组，在出现完全野生型孢子对(++)同时，也应出现对应重组产物-双突变型孢子对(pdxpdxp)。然而如图9-1B发生情况，好象pdxp转变成了pdxp＋(或+)，这些不寻常情况，好象是因为一个基因转变为它等位基因，所以将这种情况称为基因转变（geneconversion）。图9-1中以表示pdxp基因发生了基因转变。遗传重组专业知识专家讲座第40页在粪生粪壳菌（Sordariafimicola）中也发觉有基因转变现象。Olive等对g座位进行了广泛研究，g-子囊孢子为灰色，而g+子囊孢子为黑色。g+′g-杂交，在所分析200,000个子囊中，绝大部分属于正常4g+:4g-类型，但也发觉有0.06%是5:3分离，0.05%是6：2分离，还有0.008%是3：1：1：3或异常4：4分离。遗传重组专业知识专家讲座第41页AAAAaaaa粪生粪壳菌(Olive):GA×gaGA非重组孢子对GagaGAgAga非重组孢子对重组孢子对，一个孢子基因转变重组孢子对，一个孢子基因转变遗传重组专业知识专家讲座第42页在异常4：4子囊中，即使也是有4个g+和4个g-，但排列方式特殊，一个孢子对中两个孢子有着不一样基因型，而在正常情况下，它们应有相同基因型，因为每一孢子对都是一次有丝分裂产物。另外，在粪生粪壳菌中，即使g/+这对等位基因表现不寻常分离，不过邻近基因A/a都展现正常分离(图9-3)。从粪生粪壳菌基因转变资料能够看出，它有个主要特点：即在有基因转变子囊中，基因转变和遗传重组都发生在一样两个单体子囊百分比竟高达90%（图9-3），换句话说，基因转变跟遗传重组是相关，这也是基因转变与基因突变差异。遗传重组专业知识专家讲座第43页即使g/+这对等位基因表现不寻常分离，不过邻近基因A/a都展现正常分离

在发生基因转变产生异常4:4分离(3:1:1:3)和5:3分离粪生粪壳菌中，与g+/g-基因邻近A/a基因(用灰底表示A，白底表示a)呈2:2正常分离遗传重组专业知识专家讲座第44页遗传重组专业知识专家讲座第45页（二）基因转变类型染色单体转变：2：6或6：2分离比

减数分裂4个产物中，一个出现基因转变半染色单体转变：5：3；3：1：1：3

减数分裂四个产物中，一个或2个二分之一出现基因转变

减数分裂后分离：等位基因分离发生在减数分裂后有丝分裂中遗传重组专业知识专家讲座第46页（三）基因转变分子机制

基因转变实质：重组过程中留下局部异源双链区，在细胞内修复系统识别下不一样酶切/不酶切产生结果。不一样切除会产生不一样结果。一对同源染色体有4个染色单体，每一染色单体是一条DNA双链，所以一对同源染色体有4条DNA双链。在晚偶线期和早粗线期染色体配对时，同源非姊妹染色单体DNA分子配合在一起；核酸内切酶识别DNA分子上对应断裂点（breakagepoint），在断裂点地方把磷酸二酯键切断，使两个非姊妹DNA分子各有一条链断裂；两断链从断裂点脱开，螺旋局部放松，单链交换准备重接；在连接酶作用下，断裂以交替方式跟另一断裂点相互联结，形成一个交联桥（cross-bridge），这结构又称Holliday中间体（Hollidayintermediate）;遗传重组专业知识专家讲座第47页这交联桥不是静态，能够靠拉链式活动沿着配对DNA分子向左右移动，其中互补碱基间形成氢键从一条亲本链改为另一条亲本链，于是移动后在两个亲本DNA分子间留下较大片段异源双链DNA，这种结构又称为Holliday结构；随即这交联桥两臂围绕另外两臂旋转成为十字形，并在交联部分断开，消除交联体，恢复为两个线性DNA分子，即形成Holliday结构异构体(图9-4H)；断开方向或沿东西轴进行，或沿南北方向进行(图9-4I)；如沿东西方向切断，即上连、下连，则产生两个异源双链两侧基因为AB和ab，仍保持亲代类型，如沿南北方向切割，即左连、右连，则两侧基因为Ab和aB，产生两个重组类型，但不论是那种情况，即Holliday结构断裂是否造成旁侧遗传标识重组，它们都含有一个异源双链DNA区，相关两核苷酸区段分别来自不一样亲本，从而由原来G-C、A-T配对变为G-A、C-T非配对。遗传重组专业知识专家讲座第48页从Holliday模型已清楚地表明在对称异源双链区存在着不配对碱基(如G-A、C-T)，这种异源DNA是不稳定，细胞内修复系统能够识别不配对碱基，并以其中一条链为模板进行切除修复。在上面粪生粪壳菌杂交中，假设用于g+′g-杂交两亲本仅有一对碱基之差，如：不相当碱基对遗传重组专业知识专家讲座第49页不配正确核苷酸在DNA分子中造成歪斜，不配正确一小段首先由核酸外切酶(exonuc1ease)切除，留下单链缺口；然后在DNA聚合酶作用下，以一条链为模板合成含有互补碱基区段，填补缺口，再由连接酶作用，把新合成短链以共价键联接上去，成为连续核苷酸链，完成修复过程，从而完成修复过程。在修复时，因为切除不配对碱基区段不一样，能够有以下两种方式图(9-5)：如对不相当碱基对G-A修复，因为切去区段不一样，或者在染色单体中形成一个野生型基因（+），或者在染色单体中形成一个突变型基因（g）。遗传重组专业知识专家讲座第50页遗传重组专业知识专家讲座第51页依据切除修复原理，基因转变几个类型产生分子机制能够归纳以下（图8-8）。1．两个杂种分子均未校正（图8-8A）复制后出现异常4＋∶4g（或3∶1∶1∶3）分离。2．一个杂种分子校正为+，或校正为g时，则发生另一个类型半染色单体转变，前者修复后出现5∶3分离，后者子囊孢子异常分离比为3∶5（图8-8B）。遗传重组专业知识专家讲座第52页3．两个杂种分子都被校正到+（或g）时（图8-8C），修复后出现6＋∶2g（或2＋∶6g）异常分离。这便是出现染色单体转变起因。4．当两个杂种分子都按原来两个亲本遗传结构进行修复时，则减数分裂4个产物恢复成G-C、G-C、A-T、A-T正常配对状态，子囊孢子分离正常，展现4＋∶4g结果，如图8-8D所表示。遗传重组专业知识专家讲座第53页遗传重组专业知识专家讲座第54页四、Meselson-Radding模型Holliday模型中为对称杂合双链，而实际情况有不均等分离现象，1975年Meselson-Radding提出模型解释这种不对称重组现象：1.单链切断2.链置换3.单链入侵4.泡切除5.链同化（碎链吸收）6.异构化——Holliday7.分支迁移遗传重组专业知识专家讲座第55页遗传重组专业知识专家讲座第56页五、负干涉负干涉：两个邻近基因，尤其一个基因不一样突变点间，双交换频率比预期高，并发系数C>1，即一个区域交换引发邻近区域交换增加。局部负干涉：负干涉形成原因是存在并不伴随两侧遗传标识重组基因转变。遗传重组专业知识专家讲座第57页第三节细菌同源重组一、细菌同源重组特点细菌接合、转化以及转导重组都是同源重组，而且这种重组是发生在一个完整环状双螺旋DNA分子与一个双链或单链DNA分子片段之间。且重组需要3种基因所编码RecA和RecBC蛋白质。

遗传重组专业知识专家讲座第58页RecA蛋白：多功效蛋白1.NTP酶活性：存在单链DNA时，RecA具水解ATP/dATP活性，促进联会。2.单链DNA结合活性：RecA蛋白与单链DNA形成丝状复合物，使其免受核酸酶攻击。3.DNA解旋活性：DNA为单链或寡聚核苷酸。RecA蛋白在双链DNA单链切口处解开双螺旋4.部分单链DNA区，RecA蛋白促进DNA分子间联会。RecA蛋白异源双链区遗传重组专业知识专家讲座第59页RecBC：溶解酶(Resolvase)活性,断裂Holliday结构交联桥完成重组。遗传重组专业知识专家讲座第60页二、细菌转化重组机制实质：单链DNA片段与完整DNA之间重组，以下情况：①切除外源DNA——无重组②切除受体DNA——发生重组③无修复作用——子代细胞出现两种基因型（受体基因型和重组体基因型）*通常采取有利于重组体基因型生长选择条件遗传重组专业知识专家讲座第61页遗传重组专业知识专家讲座第62页高效率标识（high-efficiencymaker)：在转化中，有些遗传标识或是极少发生校正作用，或是校正切除几乎总是在受体DNA上，所以转化频率较高，这类遗传标识称为~。低效率标识（low-efficiencymaker）：转化中一些标识校正切除总是倾向于发生在供体单链上，因而出现很低转化频率，这类标识称为~。遗传重组专业知识专家讲座第63页三、细菌接合与转导中重组机制接合重组（Hfr与F-之间进行）部分DNA进入细胞，且只有其中部分参加重组，需要RecA和RecBC参加，机制与转化重组相同转导重组（phage-DNA与细菌之间）双链DNA与完整双链DNA之间重组，供体DNA以双链进入受体细胞，而且以双链形式整合进入染色体，需要RecA和RceBC参加。遗传重组专业知识专家讲座第64页四、原核生物重组酶学基础（1）RecBCD酶系统与重组起始RecBCD复合体是recB、C、D基因编码。含有螺旋酶（helicase）和外切酶（exonuclease）活性（5′→3′及3′→5′），特异性识别双链断裂部位（double-strandbreak）。①RecBCD复合物遗传重组专业知识专家讲座第65页③RecBCD引发双链降解CHI位点在E.coliDNA中大约每5-10kb中就有一个。②CHI位点在λ噬菌体DNA上发觉引发高频重组位点。5’-GCTGGTGG-3’3’-CGTCCACC-5’i）识别双链断裂ii）移动到CHI位点，并解旋DNA双链。iii）利用外切酶活性降解DNA双链。遗传重组专业知识专家讲座第66页iii）抵达CHI位点时3’5’外切酶活性被抑制，但5’3’外切酶活性加强。iv）结果形成了一个3’突出端，提供RecA识别重组。遗传重组专业知识专家讲座第67页（2）RecA与单链入侵、同源配对、Holliday结构形成①RecAi）能与任何单链DNA（single-strandDNA，ssDNA）结合。iii）能开启单链DNA与之同源双链DNA链配对。引发单链取代（singlestranduptake），形成一个Holliday结构。ii）有ATP酶活性。遗传重组专业知识专家讲座第68页Hollidaystructure遗传重组专业知识专家讲座第69页（3）Ruv与交叉点移动、Holliday结构分离①Ruv蛋白特异性地识别Hollidaystructure。ii）RuvB有helicase和ATPase活性，发动交叉点迁移。iii）RuvC内切酶活性，切割Holliday结构分枝点i）RuvA遗传重组专业知识专家讲座第70页RuvAB结合Holliday结构电镜模型两个RuvB六聚体（hexamer）以相反方向缠绕在DNA外边，“拧”动DNA双螺旋。遗传重组专业知识专家讲座第71页②Ruv作用过程i）RuvA和RuvB结合到Holliday结构上。ii）造成分枝点以10-20bp/s迁移。遗传重组专业知识专家讲座第72页iii）两个分子RuvC分别结合到RuvA相反方向上遗传重组专业知识专家讲座第73页v）重新连接上，形成重组分子（或非重组分子）iv）RuvC切断DNA，（有两种切割方式。）重组分子遗传重组专业知识专家讲座第74页第四节位点专一性重组一、λ噬菌体整合和切除

λ噬菌体：attPPOP、

大肠杆菌：attB/attλBOB、

1.整和：BOB、+POP、BOP、+POB、

2.切除：BOP、+POB、BOB+POPIntIHFInt,XisIHF遗传重组专业知识专家讲座第75页

经过attP和attB间相互重组，环状噬菌体DNA转换为整合原噬菌体，原噬菌体经过attL和attR间相互重组而切除遗传重组专业知识专家讲座第76页由重组酶（recombinase）催化，发生在特殊序列对之间。一、DNA在E.coliDNA特殊位点整合1.附着位点（attachmentsite,att）位于细菌DNA上att序列称为attB；（1）attBBOB’遗传重组专业知识专家讲座第77页（2）attP位于λ上att序列称为attP。POP’（3）关键序列（coresequence）O是attB与attP共有15bp相同序列。（4）交织剪切序列关键区中7bp：GCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATTTTTATACAAATATG是Int（整合酶）结合位点。遗传重组专业知识专家讲座第78页2.整合过程BOB’POP’BOB’P’λOPλDNA细菌DNAInt：integrase（噬菌体基因产物）；IHF：integrationhostfactor（细菌基因产物）Int、IHF遗传重组专业知识专家讲座第79页3.关键区重组细节GCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATTBB’GCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATTP’P切断后重接细菌DNAλDNA遗传重组专业知识专家讲座第80页CGAAAAAATATGCGAAAAAATATGTTTATACTAAGCTTTGCTTTATTTTTATACTAAATTP’BB’P遗传重组专业知识专家讲座第81页CGAAAAAATATGCGAAAAAATATGTTTATACTAAGCTTTGCTTTATTTTTATACTAAATTP’BB’PλDNA细菌DNA动画演示:位点特异性重组遗传重组专业知识专家讲座第82页遗传重组专业知识专家讲座第83页第五节异常重组－原核生物中转座子Transposonsaregeneticunitsthatcanmoveorbe“transposed”withinthegenome.Themovementofgeneticunitsfromoneplaceinthegenometoanotheroftendisruptsgeneticfunctionandresultsinphenotypicvariation。Assuch，theimpactofthetranspositionofgeneticunitsoftenfitintoabroaddefinitionofmutation.遗传重组专业知识专家讲座第84页转座发觉转座元件首先是由美国遗传学家BarbaraMcClintock于1951年在玉米遗传学研究中发觉。获1983年Nobel生理学和医学奖。她称之为控制元件（controllingelement）。并提出了转座（transposition）概念。遗传重组专业知识专家讲座第85页DNAtransposableelement遗传重组专业知识专家讲座第86页Mendel独立分配与自由组合遗传规律、Morgan连锁交换规律、Watson-CrickDNA双螺旋、McClintock转座，都是遗传学上最重大发觉。但只有McClintock是孤身一人，在没有任何前人经验借鉴和同仁了解与接收情况下作出。用传统试验方法取得了分子遗传学划时代发觉（比DNA双螺旋结构发觉还早两年！）。遗传重组专业知识专家讲座第87页一、原核生物转座子发觉1.JamesShapiro观察1967年，Shapiro在半乳糖操纵子研究中发觉一个奇怪突变。PgalTgalEgalK半乳糖差向异构酶半乳糖尿苷酰转移酶半乳糖激酶（1）半乳糖操纵子遗传重组专业知识专家讲座第88页（2）半乳糖代谢UDP-GalUDP-GluGal-1-PGalKTE中间产物Gal-1-P有毒，不能积累！突变株galT-

不能生长，但假如galK突变（galK-），或galT-恢复突变，就能成活。意外发觉：（3）半乳糖突变galE-

galT-双突变也能生长！遗传重组专业知识专家讲座第89页（4）分析结果此突变能够恢复，说明不是缺失或移码突变；诱变剂处理不能提升恢复突变率，说明也不是点突变。E突变造成了下游位点K活性大幅度降低了，细胞中不积累Gal-1-P。其它还有什么样突变能引发这种极性突变呢？（5）分析原因极性突变体是指那些影响位于突变位点下游一个或多个正常基因表示突变体遗传重组专业知识专家讲座第90页（6）推测及证实鉴于F因子和λ整合作用发觉，Shapiro推测，可能也是部分DNA片段插入（突变）和撤离（恢复）造成。Shapiro小组和PeterStarlinger小组分别进行了密度梯度离心和分子杂交试验，证实突变DNA中确实有插入片段。突变gal野生型galIS1称之为IS1（insertionsequence1）在转导过程中l噬菌体能够将宿主菌DNA整合到它自己基因组中，将含有gal+和galm(极性突变体)l噬菌体分别分离出来，同时加入到离心管中进行CsCl密度梯度离心，结果出现了两条带，ldgalm密度大于ldgal+密度，表明ldgalm有可能含有小片断DNA插人。遗传重组专业知识专家讲座第91页（7）IS2Xn：中心区域两侧IR序列并非完全相同，配对时会有茎环。遗传重组专业知识专家讲座第92页含有IS2半乳糖操纵子与野生型DNA杂交遗传重组专业知识专家讲座第93页IS是最简单转座因子，它仅含有编码其转座所需酶-转座酶(transposase)基因，本身没有任何表型效应。当前已知IS最少有10余种，如IS1、IS2、IS3等(表9-3)。即使它们大小不一样，当前已知IS长度在700-5700bp之间，但有一些共同结构特征，如每种IS两端核苷酸序列完全相同或相近，但方向相反，称为反向重复序列(invertedrepeatsequence,IR)，这种末端反向重复序列有几个到几十个核苷酸对，经典为15-25bp。因为这种反向重复序列存在，所以IS(或带有IS质粒)经变性和复性后，能够观察到茎环结构存在。遗传重组专业知识专家讲座第94页遗传重组专业知识专家讲座第95页IS转座过程是这么：首先由转座酶交织切开宿主DNA上靶位点，靶位点普通是随机，然后插入IS，即IS与宿主单链末端相连，余下缺口由DNA聚合酶和连接酶加以填补，结果使插入IS两端形成短(2-13bp)正向重复序列(directrepeatsequence,DR)。遗传重组专业知识专家讲座第96页（2）IS转座过程①编码序列转录合成转座酶（transposase)。②转座酶结合到转座子两个IR位点，将IS从原有位点以平端（bluntend）形式准确地切下（不包含DR）。遗传重组专业知识专家讲座第97页③转座酶同时在要插入靶序列上制造一个交织切口，带有5’单链尾。遗传重组专业知识专家讲座第98页④转座酶又把切下来平头转座子与靶位点两个5’单链尾连接。⑤细胞内复制酶把两侧缺口补上，形成正向重复（DR）ATGCATGCATACGTACGT插入序列遗传重组专业知识专家讲座第99页转座酶表示水平普通很低，所以转座事件发生频率很低（10-3~10-4/代）。ATGCATG

GCATGCATACGTACCGTACGT插入序列遗传重组专业知识专家讲座第100页2.Tn转座子（transposonelements）（1）Tn结构又称为Bacterialtransposons、复合转座子。两侧各一个IS，中间一个抗生素抗性基因（antibiotic-resistancegene）。①主体结构②正向重复（DR），起源与ISDR相同。遗传重组专业知识专家讲座第101页（2）Tn转座过程IRIRIRIR抗生素抗性转座酶转座酶ISISIS抗生素抗性基因两侧IR普通突变，致使转座酶不能识别。转座酶只能识别最末端IR，并切下整个Tn。插入靶序列和连接过程与IS元件一样。遗传重组专业知识专家讲座第102页（3）Tn类型IS50KanrBlerStrrIS50Tn5：5700bpTn9：2638bp1500bpIS1CamrIS1768bpIS10TetrIS101400bpTn10：9300bpTnAIR转座酶抗生素抗性IR38bp遗传重组专业知识专家讲座第103页第六节异常重组－真核生物转座子一、真核生物转座子发觉1.MarcusRhoades观察1938年，Rhoades分析一个自花授粉墨西哥玉米色斑遗传，发觉了意外花斑点突变。有色、白色、花斑色遗传重组专业知识专家讲座第104页（1）杂交表明，有色和白色是两对基因自由组合。有色：A1___白色：a1a1dtdt花斑色：a1a1Dt_怎样解释花斑色表型与其基因型关系？花斑色：a1a1Dt_白色：a1a1dtdt（2）测交：有色：A1___花斑色白色？遗传重组专业知识专家讲座第105页测交出现完全有色后代，说明发生了恢复突变（a1A1）。说明花斑色玉米粒中每一个色斑实际上是恢复突变表型效应。（高频率恢复突变！）但这种突变似乎与Dt存在亲密相关。因为a1a1Dt_是花斑色，而a1a1dtdt只能是白色。即：Dt存在时，a1不稳定（很轻易突变）；Dt缺乏时（dt），a1

就稳定。遗传重组专业知识专家讲座第106页2.McClintock伟大发觉BarbaraMcClintock在1940-1950年分析了玉米胚乳（endosperm）色素遗传。紫色、花斑色、白色遗传重组专业知识专家讲座第107页花斑色是因为突变造成，而且这种突变不是常规突变，是与一个“控制因子”（controllingelement)存在引发。（2）解释假如有C基因，胚乳合成色素，呈紫色；假如C突变（c），胚乳无色素，呈白色。在c胚乳发育过程中，部分细胞发生恢复突变（C），形成色斑。突变发生越早，色斑就越大。（1）杂交结论遗传重组专业知识专家讲座第108页玉米色斑，大小不一遗传重组专业知识专家讲座第109页（3）对突变解释：Ac-Ds系统为何总是恢复突变、而且高频率？McClintock认为C突变为c是因为一个“可移动控制因子”（transposablecontrollingelement）插入引发，她称之为Ds（dissociator）。①解离因子Ds遗传重组专业知识专家讲座第110页另外还有一个控制因子Ac（activator），它能激活：②激活因子AcDs插入C基因（引发突变），或从C基因中转出（恢复突变）。W:white（C基因）遗传重组专业知识专家讲座第111页在插入位点上造成8bp正向重复（DR），并造成染色体断裂。Ac引发Ds插入色素基因遗传重组专业知识专家讲座第112页Ac也能够引发Ds解离色素基因突变恢复突变遗传重组专业知识专家讲座第113页动画演示Ac-Ds引发玉米色素突变遗传重组专业知识专家讲座第114页（4）Ac-Ds基因结构第一个Ac因子长4563bp，与细菌转座子非常相同。①Ac——可自主转座元件i）两端各11bpIR（invertedrepeat）。5’-CAGGGATGAAA-3’3’-GTCCCTACTTT-5’ii）中间有5个外显子（exion）遗传重组专业知识专家讲座第115页两个开放阅读框（openreadingframe，ORF），和3个非编码区（noncodingregion，Nc）。编码转座酶。转座酶识别两头IR序列。遗传重组专业知识专家讲座第116页②Ds家族——各种各样Ac缺失突变第一个Ds因子（Ds-a）几乎就是Ac大ORF缺失一段194bp后结果。这就是Ds依赖Ac原因。位于玉米第9号染色体短臂，在色素基因（C）附近。丧失了转座能力遗传重组专业知识专家讲座第117页各种Ds与Ac关系遗传重组专业知识专家讲座第118页遗传重组专业知识专家讲座第119页二、果蝇中转座子1.Copia1975年，DavidHogness和同事们在果蝇（Drosophilamelanogaster）中发觉一类基因，能转录出大量（copious）RNA。在基因组中到达30份拷贝。他们所以称之为copia。有30个果蝇转座子家族，占果蝇基因组5%。（占中度重复序列二分之一以上）。遗传重组专业知识专家讲座第120页果蝇染色体中copia分布分散在基因组中遗传重组专业知识专家讲座第121页（1）copia结构5000-8000bp长；①DTR两端各有276bp正向末端重复（directterminalrepeat,DTR)遗传重组专业知识专家讲座第122页②ITR在每个DTR内部各有一个17bp反向末端重复（invertedterminalrepeat，ITR）DTR序列在其它生物转座子中也发觉过，但并不普遍。ITR短序列是普遍存在。③与逆转录病毒同源性序列分析表明它与retroviralDNA同源。可能是个逆转座子。遗传重组专业知识专家讲座第123页17.6和Ty912是酵母转座子遗传重组专业知识专家讲座第124页2.P因子（Pelement）果蝇杂交不育（hybriddysgenesis）：P型果蝇（paternalcontributing）与M型（maternalcontributing）杂交：P♂×M♀F1不育P♀×M♂F1可育F2（1）杂交试验遗传重组专业知识专家讲座第125页遗传重组专业知识专家讲座第126页遗传重组专业知识专家讲座第127页（2）细胞学检验P型雄果蝇染色体上含有大量插入，插入序列称为Pelement。M型雌果蝇染色体上没有Pelement。（3）Pelement结构（全部试验室果蝇几乎都是M型）ORF0ORF1ORF2I1I2I3ORF3IRIR①4个开放阅读框（ORF）②3个内含子（I）③两端各一个反向重复（IR）遗传重组专业知识专家讲座第128页（4）Pelement作用过程只在生殖细胞中实现转座。在体细胞中即使也转录，但转录出产物没有转座酶活性！①组织特异性原因：转录后剪切不一样。i）体细胞中只有前两个内含子被剪切。有一个蛋白结合在第三个内含子（内有终止密码）上，抑制第三个内含子剪切。遗传重组专业知识专家讲座第129页翻译产物是ORF0-ORF1-ORF2=66kDa蛋白质。这个66kDa蛋白功效恰好是个抑制转座抑制物。（在P型雌果蝇卵细胞质中大量存在，而且稳定；M型雌果蝇中没有）。ORF0ORF1ORF2I1I2I3ORF3IRIRORF0ORF1ORF2I3ORF3ORF0ORF1ORF2转录、剪切翻译mRNA66kDa蛋白遗传重组专业知识专家讲座第130页ii）在生殖细胞中ORF0ORF1ORF2I1I2I3ORF3IRIRORF0ORF1ORF2ORF3ORF0ORF1ORF2转录、剪切翻译mRNAORF3转座酶没有蛋白质抑制第三个内含子剪切。87kDa转座酶：使P因子转座。造成不育。遗传重组专业知识专家讲座第131页②转座离开原位，直接插入到其它位点。P♂×M♀F1不育P♀×M♂（P♂）F1可育F2卵细胞质有P，有66kD有P卵细胞质无P，无66kD转座不转座（66kD抑制P）无P、有P30多年前在野外捕到黑腹果蝇都是M型，最近10年捕到都是P型。遗传重组专业知识专家讲座第132页遗传重组专业知识专家讲座第133页三、反转座子（retrotransposons）以RNA为中介，反转录成DNA后进行转座可移动元件。1.反转座子类型可分为两类：（1）病毒型反转座子（viralretrotransposons）（2）非病毒型转座子（nonviralretrotransposons）全部真