生理所黄阿敏

生理所黄阿敏第1页，共40页，2023年，2月20日，星期六ComparisonofSouthern,Northern,andWesternanalysesofGeneX第2页，共40页，2023年，2月20日，星期六SouthernhybridizationFirstdescribedbyE.M.Southernin1975.ApplicationsofSouthernhybridizationRFLP’s,VNTR’sandDNAfingerprintingCheckingofthegeneknockoutmiceTheflowchartofSouthernhybridization第3页，共40页，2023年，2月20日，星期六SouthernhybridizationTransferbuffer第4页，共40页，2023年，2月20日，星期六DetectionofanRFLPbySouthernblotting第5页，共40页，2023年，2月20日，星期六Detectionofthesickle-cellglobingenebySouthernblotting第6页，共40页，2023年，2月20日，星期六Checkingofthegeneknockoutmice第7页，共40页，2023年，2月20日，星期六FlowchartofSouthernhybridizationPreparingthesamplesandrunningthegelSoutherntransferProbepreparationPrehybridizationHybridizationPost-hybridizationwashingSignaldetectionIsotopeNon-isotope第8页，共40页，2023年，2月20日，星期六PreparingthesamplesandrunningthegelDigest10pgto10gofdesiredDNAsamplestocompletion.Prepareanagarosegel,loadsamples(remembermarker),andelectrophorese.Staingelethidiumbromidesolution(0.5g/ml).Photographgel(withruler).第9页，共40页，2023年，2月20日，星期六Criticalparameters(I)NotethecomplexityofDNAGenomicDNAAsingle-copyofmammaliangene,3Kbaverageinlength10mgx3Kb/3x106Kb=10mgx1/106=10pgPlasmidDNAorPCRproducts0.1mgofa3KbplasmidDNA100ng第10页，共40页，2023年，2月20日，星期六GeltreatmentAcidtreatment0.2NHClsolutionDenaturationNaOHsolutionNeutralizationTris-Clbuffer(pH8.0)第11页，共40页，2023年，2月20日，星期六SoutherntransferMeasuregelandsetuptransferassembly:Wickintraywith20xSSCGelNitrocelluloseorNylonfilters(soakedinH2Oand20xSSC)3MMWhatmanfilterpaperPapertowelsWeight第12页，共40页，2023年，2月20日，星期六AfterSoutherntransferDissembletransferpyramidandrinsenitrocellulosein2xSSCBakenitrocelluloseat80Cfor2hrorUV-crosslinkNylonmembraneforseconds第13页，共40页，2023年，2月20日，星期六PreparationofprobesSynthesisofuniformlylabeleddouble-strandedDNAprobesPreparationofsingle-strandedprobesLabelingthe5and3terminiofDNA第14页，共40页，2023年，2月20日，星期六Synthesisofdouble-strandedDNAprobesNicktranslationofDNALabeledDNAprobesusingrandomoligonucleotideprimers第15页，共40页，2023年，2月20日，星期六Nicktranslation第16页，共40页，2023年，2月20日，星期六Preparationofsingle-strandedprobesSynthesisofsingle-strandedDNAprobesusingbacteriophageM13vectors.SynthesisofRNAprobesbyinvitrotranscriptionbybacteriophageDNA-dependentRNApolymerase.第17页，共40页，2023年，2月20日，星期六Invitrotranscription第18页，共40页，2023年，2月20日，星期六

Labelingthe3terminiofdouble-strandedDNAusingtheKlenowfragmentofE.coliDNApolymeraseI.(lackof5’3’exonucleaseactivity)Labelingthe3terminiofdouble-strandedDNAusingbacteriophageT4DNApolymerase.Labelingthe5terminiofDNAwithbacteriophageT4polynucleotidekinase.Labelingthe5and3terminiofDNA第19页，共40页，2023年，2月20日，星期六T4polynucleotidekinaseactivity第20页，共40页，2023年，2月20日，星期六Non-isotopelabelingDigoxigenin-11-dUTP(DIG-dUTP)labelingDNAlabelingOligonucleotidelabelingRNAlabeling第21页，共40页，2023年，2月20日，星期六PCRLabeling,RandomPrimedLabeling,andRNALabeling第22页，共40页，2023年，2月20日，星期六PrehybridizationAddprehybridizationsolutionandprehybridizeathybridizationtemperaturefor2-4hr第23页，共40页，2023年，2月20日，星期六HybridizationRemoveprehybridizationsolutionandaddhybridizationsolutionAdd500,000cpmoftheprobe/mlhybridizationsolution.Hybridizeovernightatappropriatetemperature.第24页，共40页，2023年，2月20日，星期六Post-hybridizationwashingWashtwice,15mineach,in1xSSC,0.1%SDSatroomtemperature.Washtwice,15mineach,in0.25xSSC,0.1%SDSathybridizationtemp第25页，共40页，2023年，2月20日，星期六Criticalparameters(II)HomologybetweentheprobeandthesequencesbeingdetectedTm=81+16.6(logCi)+0.4[%(G+C)]-0.6(%formamide)-600/n-1.5(%mismatch)Factorscanbechanged:Hybridizationtemp.Washingtemp.SaltconcentrationduringwashingHightemp.,lowsalt:highstringencyLowtemp.,highsalt:lowstringencyIf50%formamideisused42oCfor95~100%homology37oCfor90~95%homology32oCfor85~90%homology第26页，共40页，2023年，2月20日，星期六ComparisonofnitrocelluloseandnylonmembranesNCNylonHydrophobicbindingCovalentbindingFragileDurableProbelength>200~300bp<200~300bpisO.K.LowerbackgroundHigherbackgroundCannotbeexposedtobasicsolutionCanbeexposedtobasicsolutionNoteasilyreprobedCanbereprobedseveraltimes第27页，共40页，2023年，2月20日，星期六SignalsdetectionAutoradioragraphyNon-isotopedetectionsystemChemiluminescentdetectionColorimetricdetectionMulticolordetection第28页，共40页，2023年，2月20日，星期六AutoradiographyExposuretox-rayfilm第29页，共40页，2023年，2月20日，星期六NorthernblottingorNorthernhybridizationTechniquefordetectingspecificRNAsseparatedbyelectrophoresisbyhybridizationtoalabeledDNAprobe.第30页，共40页，2023年，2月20日，星期六TheflowchartofNorthernhybridizationPrepareRNAsamplesandrunRNAgelNortherntransferProbepreparationPrehybridizationHybridizationPost-hybridizationwashingSignaldetectionIsotopeNon-isotope第31页，共40页，2023年，2月20日，星期六Preparationofagarose/formaldehydegelE.g.Preparea350ml1.2%agarose/formaldehydegel4.2gagarosein304.5gwater.Microwave,thencoolto60C.Add35ml10xMOPSrunningbufferand10.5ml37%formaldehyde第32页，共40页，2023年，2月20日，星期六PreparationofRNAsamplesPrepareapremix:5lof10xMOPSrunningbuffer8.75lof37%formaldehyde25lofformamide.PrepareRNAsamples:38.75lofpremixRNA(0.5to10g)*waterto50l*IfthemRNAspeciesofinterestmakesuparelativelyhighpercentageofthemRNAinthecell(>0.05%ofthemessage),totalcellularRNAcanbeused.IfthemRNAspeciesofinterestisrelativelyrare,however,itisadvisabletousepoly(A)+RNA.Incubate15minat55C第33页，共40页，2023年，2月20日，星期六RunningtheRNAgelAdd10lformaldehydeloadingbuffertoeachsampleandloadgel.Rungelat100to120Vfor~3hr.Removegelfromtherunningtankandrinseseveraltimesinwater.Placegelin10xSSCfor45min.Donotneedpost-transferringgeltreatment第34页，共40页，2023年，2月20日，星期六AnexampleofNorthernblottingNorthernblotRNAgel28S18S第35页，共40页，2023年，2月20日，星期六Westernblotting,orimmunoblottingTechniquefordetectingspecificproteinsseparatedbyelectrophoresisbyuseoflabeledantibodies.第36页，共40页，2023年，2月20日，星期六FlowchartofWesternblottingElectrophoresingtheproteinsampleAssemblingtheWesternblotsandwichTransferringproteinsfr