大肠杆菌的培养

/大肠杆菌种子液的制备牛肉膏蛋白胨培养基的配方：液体培养基牛肉膏3．０ｇ蛋白胨10。０g氯化钠5．0g水1000mlpH7.4—7。6固体培养基在液体培养基的基础上再加入1。5％－2。0％的琼脂１试管斜面与平板的制备称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后,在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后，补充水到所需的总体积。将称量好的１．8%琼脂放入已溶的药品中,再加热熔化，最后补充所损失的水分。调ＰH在未调PH前,先用精密ＰH试纸测量培养基的原始ＰH,如果偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mｏl/LNaOH,边加边搅拌，并随时用PH试纸测基PＨ直到PＨ达到7.4—７．6。反之用1mｏｌ/LHCl进行调节。分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。其试管装量不超过管高的1／5，三角烧瓶的量不超过1／2加塞培养基分装完毕后，在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸,其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期。灭菌将上述培养基以0．1Mpa，121℃，1５ｍiｎ倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃2接种大肠杆菌斜面种子(1）取实验室储备的大肠杆菌BL2１种子,在酒精灯附近，用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。（2）将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h３制备平板种子（1)在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面,用无菌生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度稀释为1倍,10倍，1０0倍和1000倍，用移液枪分别吸取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板,每次吸取溶液1０0uｌ)，然后在３7℃（１2）次日，挑取生长状态好，特征明显的单个菌落,接种于新鲜灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中37℃，１7０r／ｍin恒温振荡培养１8h作种子培养液。其后的实验中,每次实验前从种子培养液中吸取2ｍｌ菌液接种于新鲜灭菌的液体培养基中,3７℃，1７0r/min恒温振荡培养使用牛肉膏蛋白胨培养基

组成成分:牛肉膏３g，蛋白胨10g，Nacl5ｇ，琼脂１5~20g,水1000ｍL,ＰH7.4～７.6。

具体配置步骤:

1．称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片.蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。

2.加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上，小火加热,并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量．若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中，需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分.ﻭ３。调pＨ检测培养基的pＨ，若pH偏酸，可滴加lｍol/ＬNaOH，边加边搅拌，并随时用pＨ试纸检测,直至达到所需pH范围．若偏碱，则用lmol/ＬHＣl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前．应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度．ﻭ４。过滤液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察．但是供一般使用的培养基,这步可省略。

5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染.

分装量:固体培养基约为试管高度的l/５,灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜.半固体培养基以试管高度的1/３为宜,灭菌后垂直待凝。ﻭ6.加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状，大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁,不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用.要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落.有些微生物需要更好的通气,则可用8层纱布制成通气塞.有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。

７．包扎加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞.若培养基分装于试管中,则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好.然后用记号笔注明，培养基名称，组别,日期.ﻭ8.灭菌将上述培养基于121．３℃湿热灭菌２０min.如因特殊情况不能及时灭菌,则应故入冰箱内暂存。ﻭ９.无菌检查将灭菌的培养基放入3７℃温箱中培养２4～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。ﻭﻭ大肠杆菌的培养：ﻭ3７摄氏度，恒温培养48到72小时，因为接种时和具体培养条件的不同，其生长一般都在2天外才能长出明显的菌落.ﻭ菌落特征:乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜色一致。ﻭ大肠杆菌/大肠菌群显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养基，用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的快速检测.大肠杆菌显蓝色至紫色，大肠菌群显红色。ﻭﻭ成份(ｇ/L)ﻭﻭ特殊营养物质ﻭ２8。１９

混合显色剂ﻭ0。31ﻭ

琼脂

13。0

ﻭpH６。8±０.2２5℃ﻭ

此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。

ﻭ注意ﻭﻭ此培养基仅供实验室使用。

ﻭ用法ﻭ

称取本品４１。５ｇ加入1０00ml蒸馏水,加热溶解并不停搅拌，煮沸不要超过1分钟.取1ml制备好的样品液加入直径为９ｃm无菌平皿中心，倾入冷却至45-50℃培养基约15ｍl，混匀,凝固后，再加入一层培养基进行履盖。或冷却至45－５０℃时，倾入无菌平皿，琼脂完全凝固后，在37℃的培养箱中倒置放置1—2小时,加入适当稀释度的样品液1mｌ，涂布于培养基上,36±1℃培养１８～2４h。

ﻭ贮存ﻭﻭ制备好的平板应立即使用，应避免光线直接照射。干燥培养基应放置于阴暗干燥处，保存温度2-8℃，注意避光保存。失效ﻭﻭ干燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用。ﻭ

操作步骤

1、按国家标准、SN标准、FDＡ标准或其它方法制备样品液ﻭﻭ2、取样品液1ml加入冷却至45-５0℃显色培养基中混匀或涂布于平板上

3、36±１℃培养18～24h，选用有30~２00个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群和大肠杆菌菌落。大肠杆菌典型菌落为蓝色至紫色，大肠菌群为粉红色菌落,其它细菌为无色或黄色菌落。

总大肠菌群=蓝色菌落+紫色菌落+粉红色菌落

ﻭ大肠杆菌＝蓝色菌落+紫色菌落ﻭﻭ4、对可疑大肠杆菌菌落可划线接种到营养琼脂平板上，3６±１℃培养12-16小时，挑取单菌落做大肠杆菌全套生化试验(本公司有生化鉴定管套装２0支x3种）

ﻭ质量控制

ﻭ1、外观

此干燥培养基的粉末均匀,具有良好的流动性,呈淡红色。制备好的平板呈透明粉红色固体培养基。ﻭ

2、微生物试验

ﻭ在３6±1℃培养１8～2４ｈ小时：ﻭ质控菌株ﻭATCCﻭ生长情况ﻭ菌落颜色ﻭﻭ单增李氏菌

27853

-/+

无色

金黄色葡萄球菌ﻭ2５9２3ﻭ－／+

无色

大肠杆菌

2592２ﻭ++＋

蓝色