不同品种水稻颖果发育及其发育过程中生理活性变化的比较

不同品种水稻颖果发育及其发育过程中生理活性

变化的比较陈娟一、前言水稻（OryzaSativa）是我国主要粮食作物之一，在粮食生产中占举足轻重的地位。我国是一个人口大国，对粮食的需求量很大；同时，随着社会的发展和人们生活水平的不断提高，人们对稻米品质的要求也越来越高。因此，如何提高稻米的产量和品质是水稻栽培和育种家们研究的重点。水稻籽粒是水稻主要的收获部位，水稻产量主要就是由籽粒重来衡量的。水稻籽粒由谷壳和颖果组成。谷壳由内外稃发育而来，一般作为饲料使用。颖果也叫糙米，由子房发育而来，包括胚、胚乳（包括糊粉层）、果皮和种皮四个组成部分，内含大量的淀粉、蛋白质等贮藏物质，构成了水稻籽粒的主要部分，颖果的发育状况决定着稻米的产量和品质。因此，研究稻米的产量和品质必须从颖果着手。研究颖果的发育生理，从颖果发育的角度来阐明稻米产量和品质的形成机理也是提高水稻产量和品质的一个重要途径。二、前人的研究1、颖果的发育根据颖果发育的内部变化和颖壳色泽的变化，将颖果的发育大致分为四个阶段［J（1）乳熟期（也称灌浆期），米粒内有白色浊液，米粒背部为青色。（2）蜡熟期（也称黄熟期），米粒结硬，背部纵沟青色渐退去。（3）完熟期，米粒硬实，不易破碎。（4）枯熟期，壳色退淡，米粒透明。各期所需时间受品种、气温以及籽粒着生部位差异的影响很大，釉稻生育期短，各期时间也较短。2、水稻的胚水稻的胚是由受精卵发育而来的。水稻的胚是水稻新个体的原始体，因此也是水稻中最重要的部位。徐是雄R］曾用扫描电镜详细的观察了稻胚的形成过程（原有图），并提出了胚是由两大部分构成的，一是胚轴系统（embryonicaxis），包括胚芽、胚轴、胚根及根冠；二是胚套（embryonicenvelope），由盾片、左右复鳞、外胚叶及胚根鞘连成的套状体，胚轴系统被包裹在胚套中，它长在盾片上，盾片的维管束与胚轴系统的维管束相连，胚套的主要功能在于保护胚轴系统以及贮藏和吸收营养物质。根据胚轴系统具有长成幼小植物能力的情况，徐是雄（1982）将胚的发育过程分为三个时期：（1）胚的发芽力初步形成期，到此期结束时胚盾片的初生维管束已形成，在人工培养基上发芽率在50%以上。（2）胚的发芽力迅速提高期，该期胚干物重增长最快，发芽率迅速提高。（3）增强发芽势时期，该期胚的干物质进一步充实，抗逆性增强，发芽势更好。有关胚各部分的形态本质，徐雪宾等［3］研究又提出了一些新的见解，（1）授粉后2d的胚由胚柄、胚基和胚体组成。胚基为胚柄和胚体之间的过渡区，呈喇叭状，胚基与胚柄不能等同°2d的胚未出现器官分化，属原胚；但胚背腹分化明显，即存在背腹极性。（2）授粉后第3至第5天幼胚的形态变化及器官分化至关重要。盾片和胚芽鞘在授粉后3d的幼胚上同时出现，两者均直接由原胚分化，并非胚芽鞘从盾片发生。胚芽鞘原基经历这3d的特殊形态演变，形成空心倒锥状的胚芽鞘，展现了禾本科特有的胚芽鞘的形态形成机理。3d幼胚胚根的原形成层、基本分生组织及根冠分化；4d幼胚小丘状生长锥形成，胚根的原表皮分化，茎、根轴形成；5d幼胚胚芽、胚轴与胚根初步形成。（3）稻胚具有二型子叶，胚套是胚的外围子叶，盾片是此子叶的一个主要部分（侧生子叶），胚芽鞘是顶生子叶。3、水稻的胚乳水稻胚乳是水稻籽粒中贮藏营养物质的场所，它是由受精极核发育而来的，包括糊粉层、亚糊粉层和淀粉性内胚乳组织三个组成部分。水稻胚乳是水稻的主要食用部位，胚乳的发育状况决定着稻米的产量与品质，因此对于水稻胚乳的研究一直受到许多科学研究者的关注和重视。有关水稻的胚乳发育过程中结构的变化以及胚乳中贮藏物质的积累，前人已研究得比较清楚。首先，在结构和品质的关系方面，长户一雄等［11,12］、范燕萍［13］等曾先后用光学显微镜方法研究了稻米胚乳细胞与垩白的关系，70年代以后，不少科技工作者借助扫描电子显微镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）技术，从结构上进行米质机制的研究。前人的研究显示，胚乳细胞的大小、数量以及细胞断裂所显露的状态等与稻米品质性状（如垩白）密切相关；胚乳中的淀粉粒形态和大小在不同品质水平的品种间存在较大差异［14~19］。有关水稻胚乳的形态建成，星川清亲］曾作过大量的观察和研究，指出水稻胚乳属于核型胚乳，其发育可以分为核期（花后1~2天）和细胞期（花后第3天开始）两个时期；胚乳细胞的增殖是由位于胚乳周边的细胞分裂引起的；位于中部的胚乳细胞发育早，先积累淀粉；水稻胚乳中淀粉为复粒淀粉。4、水稻的果皮果皮是由子房壁发育而来的包裹在种子外面的包被物。对于果皮的结构，王忠等作过详细的研究并指出，水稻果皮是由子房壁发育起来的，子房壁从外到内依次由上表皮（1层细胞）、中层（数层细胞）、下表皮（1〜2层细胞）组成，分别对应形成外果皮、中果皮和内果皮。水稻受精后随着子房的伸长与膨大，上表皮细胞分裂后纵向伸长，使细胞呈长形。上表皮细胞约在花后10〜15d定形，其后细胞中的内含物消失，最后成为仅剩角质化细胞壁的细胞残体。上表皮上虽然没有气孔，但由于表皮细胞壁薄，子房或颖果能通过上表皮同外界交换水分和气体。中层细胞内含有叶绿体，使颖果在发育初期呈绿色。中层细胞中的叶绿体也具有光合作用。中层的最内层细胞因细胞长度与颖果纵轴成直角而称为横细胞。下表皮细胞呈管状，称为管细胞。三、本实验研究的内容、目的和意义（一）研究的主要内容1、颖果发育过程中各种生理活性（呼吸速率、脱氢酶活性、H2O2酶活性、SOD活性等）的变化2、颖果发育过程中各物质含量（可溶性糖、淀粉、蛋白质、ATP等）的变化3、颖果发育过程中果皮色素含量的变化4、颖果发育过程中酶种类（酶带和同工酶）的变化5、与淀粉、蛋白质合成有关的酶的变化（二）研究的目的和意义对水稻颖果发育过程中形态结构的变化，前人已研究得比较清楚，而对生理活性变化过程的研究却从来没有。本实验通过对粒重差异显著，直、支链淀粉含量不同的品种水稻颖果发育过程中各种生理生化变化的研究，一方面探明水稻发育过程中的生理生化变化过程，另一方面通过不同品种间生理生化变化的差异的比较，探明生理活性与颖果发育、籽粒重及稻米品质的关系，为稻米的高产优质育种和高产栽培提供理论依据。同时，本实验也对果皮的生理功能作了一些研究和探讨。四、材料与方法（一）供试材料水稻（OryzaSativh品种：三粒寸（大粒釉稻、千粒重42g）、大力（大粒粳稻、千粒重36g）、IR36（小粒釉稻、千粒重18g）、农垦57（小粒粳稻、千粒重21g）。下面分别简称大釉、大粳、小釉、小粳。（二）实验方法1、发育不同天数颖果的采集在开花期采用记号笔点颖和挂牌相结合的方法来正确标记颖花的开花日期，然后根据需要，相应地采集花后不同天数的颖果做实验。2、颖果鲜干重的测定每隔3天，即取花后0天、3天、6天直至成熟的颖果，剥去颖壳，以30粒为单位，称其鲜重，烘干后称干重，计算含水量。3、颖果中脱氢酶活性的鉴定TTC（2、3、5—氯化三苯基四氮唑）染色法。将纵切或横切的发育不同天数的颖果浸在0.5%的TTC溶液中，30oC下放置1h，然后在体视显微镜下观察颖果切面的染色情况，染成红色的部位即为有脱氢酶活性处，染色越深，则活性越强。4、颖果中淀粉的鉴定I2—KI染色法。将不同发育天数的颖果，纵剖和横剖，放入I2—KI溶液中，2min后取出，置体视显微镜下观察，染成蓝黑部分即为有淀粉处。5、果皮中色素的提取及色素吸收光谱的测定取10粒颖果或剥10粒颖果的果皮，放入10ml的具塞试管，向试管内加入乙醇：丙酮：水=4.5：4.5:1的混合液口】，并定容至10ml,将试管置暗中浸提果皮中的色素，待果皮褪绿（约3〜4小时）后取浸提液，用分光光度计测定浸提液的吸收光谱。6、果皮中叶绿素含量的测定按不同发育天数的颖果分别取10粒，依上述5的方法提取叶绿素后分光光度计测定其在652nm处的光密度值，并计算含量5。7、果皮的光合速率和呼吸速率的测定氧电极法。按不同发育天数的颖果，分别取10粒颖果的果皮，放入测溶解氧装置（SP-2型）的氧电极反应杯中，加入内含20mmol-L-1NaHCO3的50mmol-L-1Tris-HClpH7.2缓冲溶液的反应液，先测遮光时的呼吸耗氧速率，然后测定照光下的放氧速率（净光合），耗氧速率和放氧速率之和为果皮光合放氧活性（总光合）。8、果皮中Rubisco的定量抗体免疫电泳法。即在含有Rubisco抗体的琼脂薄胶板上，沿加样线每隔1.5cm打1个小孔，在小孔中分别加入标准抗原和从果皮中提取的粗酶液，电泳4小时后对琼脂胶板固定与染色，根据沉淀峰高度与抗原浓度的线性关系〔8）来推算加入小孔的果皮提取液中的Rubisco含量。9、颖果中H2O2酶的提取与活性测定50mmol/LTris-HCl缓冲液提取酶液。按不同发育天数的颖果，分别取3粒，称重后加入1mlPH7.0的50mmol/LTris-HCl缓冲液研磨，然后定容到10ml，得到HO粗酶液。氧电极法测定活性。在测溶解氧装置（SP-2型）的氧电极反应杯中加入适量缓冲液，再加入0.5ml粗酶液，记录基始耗氧速率。用微量注射器向反应杯中加入30ul1%HO,记录放氧速率。计算酶活性。2210、颖果中SOD的提取与活性测定用PH7.8的磷酸缓冲液提取酶液。按不同发育天数的颖果，分别取3粒，称重后加入1mlPH7.8的磷酸缓冲液［含0.1mol/LEDTA0.3%（w/v）TritonX-100；4%（w/v）聚乙烯毗咯烷酮（pvpp）］研磨，纱布过滤，10000转离心20min，即得到粗酶液。氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定活性。在盛3ml反应液（在5ml14.5mmol/Ldl-甲硫氨酸中分别加入均以PH7.8的磷酸缓冲液配置的3umol/LEDTA2.25mmol/LNBT和60umol/L核黄素各2ml，各溶液均在用前配制，避光放置）的试管中，加入200ul粗酶液混合，然后在光照培养箱内照光10分钟，立即其在560nm处的光密度值，并根据SOD抑制NBT光化还原的程度计算酶含量。11、颖果中ATP的提取与含量的测定ATP的提取用热提取法［10］。按不同发育天数的颖果，分别取5粒，放沸水浴中煮2分钟后取出冷却，剥壳，放入3ml1mol/LMgSq溶液中研磨，定容至5ml，取2ml匀浆于高速台式离心机15000转/分钟离心5分钟，取上清液备用。ATP含量的测定虫荧光素酶法［10］。取0.2ml样品提取液置于0.5cm光径的比色杯中，放入发光光度计的样品室中，用注射器注入1ml测定介质，记录发光强度高峰。同时，用浓度与样品液处于同一数量级的ATP标准液以同样的方法测定发光强度。按比例法计算样品液ATP含量。12、颖果含糖量的测定蒽酮比色法。13、颖果中淀粉含量的测定双波长法。14、颖果含N量的测定凯氏定氮法。15、颖果中四种蛋白质含量的测定Lowry测定法。16、与淀粉和蛋白质合成有关的酶的活性的测定17、同工酶（淀粉酶、SOD、过氧化物酶）聚丙烯酰氨凝胶电泳法。五、部分研究结果六、参考文献1、丁颖稻作论文选集编辑组编，丁颖稻作论文选集四、生长与发育水稻幼穗发育和谷粒充实过程的观察.农业出版社，1980，265~2902、徐是雄，3、徐雪宾，韩惠珍,刘向东，徐是雄.稻胚发育的三维形态研究兼论胚各部分的形态本质植物学报1999,41(5):472〜4784、星川亲清，第二章开花受精颖果〃发育，松尾孝岭等褊，稻学大成第一卷形态篇，日本东京：农山鱼村文化协会，1990，305~3065、王忠主编，水稻的开花与结实，江苏省作物栽培重点实验室江苏扬州江苏农学院1993，776、徐是雄、徐雪宾等编著，稻的形态与解剖I.内文七、糙米的形态结构与种子的萌发过程.农业出版社，1984，487、沈伟其.测定水稻叶片叶绿素含量的混合提取法植物生理学通讯，1988,(3)：62~648、郭尧君编著，蛋白质电泳技术，第十章免疫电泳，1.5.1laurell“火箭”免疫电泳，科学出版社)，1999,299〜3009、Fujino,Y(1978):RiceLipid.CerealChem.55:559〜571.10、王忠编著.植物生理学实验指导.扬州大学农学院农学系植物生理教研室2004,75~8311、长户一雄，小林喜男.Onvarietaldifferecnesinthetiscellofstarchtissueinricekenerl.日作纪，1959，27(4):443〜44512、江幡守卫，长户一雄.Studiesonwhite-coreoccurenceanddevelopmentofstarchtissueinricekenerl.1960，29(1):93〜9613、范燕萍，唐启源，周美兰.稻米胚乳淀粉细胞结构与米质关系的研究(I)，(II).作物研究，1988，2(1):18〜23;1989，3(2):19〜2314、梁敬火昆，王学海，卢乃等.杂交稻米及其亲本淀粉粒形态