植物总DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测课件

植物总DNA的提取

及琼脂糖凝胶电泳检测植物基因组DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)

与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。背景知识核酸的存在形式细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸基本过程①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞；③酶解法：加入溶菌酶，破坏细胞壁。

细胞破碎

SDS法SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB法CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNA提取实验材料

新鲜蔬菜叶片(去叶脉)试剂

2×CTAB抽提液TE缓冲液(pH=8.0)

氯仿：异戊醇(24:1)

材料与试剂①离心机②水浴锅③研钵④微量移液器仪器用具移液器－量程的选择1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀；2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（2－5％），尽可能选取幼嫩的材料；3）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。注意事项DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。电泳原理琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2Tris-硼酸（TBE）

Tris-乙酸（TAE）

Tris-磷酸（TPE）常用电泳缓冲液电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng。核酸染色剂注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。不同种类DNAMarker1.凝胶制备

制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入20mL0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃时，加入EB至终浓度0.5µg/mL。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。2.加样

取10µlDNA样液与2µl上样buffer混匀，用微量移液器小心加入样品槽。3.