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文档简介

实验九聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点

一、目的要求1.学习和掌握圆盘电泳技术2.学习和掌握等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点方法

二、原理 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(IsoelectricFocusing，简称IEF)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrierampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。IEF分离蛋白质并测定pI图3.6聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A为正面,B为剖面)

(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7

(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3

三、试剂与器材试剂：两性电解质载体pH3-10、10%四甲基乙二胺、10%过硫酸铵、5%H3PO4、2%NaOH、40%蔗糖、0.04％考马斯亮兰R250、7%醋酸器材：圆盘电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床四、操作方法1.凝胶柱的制备（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖)（2）配胶表10mL7.5%凝胶的配制试剂名称 体积(mL) 凝胶贮液 2.5 两性电解质载体 0.5 10%TEMED 0.1 蛋白质混合样品 0.1 蒸馏水 6.75 混匀后置真空干燥器中抽气10min 10%过硫酸铵 0.05 3．剥胶

电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极液，在凝胶条的正极端插一铜丝为标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。4.固定染色

取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色1-2h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。5.pH梯度的制作

取另一条凝胶条放在玻板上，从凝胶的正极端开始，每隔0.5cm切下一段，依次放入已编好号并装有1mL蒸馏水的试管中，浸泡过夜。次日用酸度计分别测定每管浸提液的pH值。以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度曲线。6.蛋白质样品等电点的计算

求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离

固定染色前凝胶条长度

固定染色后凝胶条长度 计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从pH梯度

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