单克隆抗体技术

单克隆抗体技术的应用魏婷婷（生命科学学院食品科学与工程发酵方向）摘要：本综述包括以下内容：简要叙述了单克隆抗体发现历史；系统地阐述单克隆抗体技术的优点和生产单克隆抗体的杂交瘤技术；介绍单克隆抗体技术在食品卫生检验中的应用。关键词：单克隆抗体杂交瘤技术应用领域引言单克隆抗体技术（monoclonalantibodytechnique）, 1975年英国科学家Milstein和Kohler所发明，并获得1984年诺贝尔医学奖。1984德国人G.J.F.Kohler、阿根廷人C.Milstein[3]和丹麦科学家N.K.Jerne由于发展了单克隆抗体技术,完善了极微量蛋白质的检测技术而分享了诺贝尔生理医学奖。它是将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体的技术。其原理是:B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。单克隆抗体单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。应用学科细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）。单克隆抗体技术的优点单克隆抗体技术是生物技术的重要内容之一。它不仅可与基因工程媲美，而且已与基因工程配合应用，将更加发挥其重大作用。这是由它们的下列优点所决定的：（一）用任何抗原、半抗原，包括各种细菌、激素、酶素、病原体、氨基酸序列、核酸，还有其他异体蛋白或糖蛋白等抗原物质

都可以用杂交瘤技术获得相应的单克隆抗体。因而人们可以在体外或动物体内按自己的需要，生产不同类型的单抗。现在，已经可以制出多种病毒、细菌、枝原体、霉菌、寄生虫表面抗原，癌胚抗原，血型红细胞抗原，移植抗原，肿瘤相关抗原，多种血清成份，DNA，RNA，基因片段等等单克隆抗体。已应用单克隆抗体制成免疫荧光技术，酶免疫吸附实单克隆抗体技术及其在食品卫生检验中的应用。单克隆抗体的提纯一般常用金黄色葡萄球菌蛋白A—琼脂糖4B亲和层析法。单克隆抗体的保存由腹水中获得的抗体,经离心去除细胞成分，再经冷冻超速离心,取上清液加0.1%NaN3,少量分装，冷冻于-70°C可保存几年。但应避免反复冻融，否则抗体失活，特别是IgM抗体。提纯的单克隆抗体，冷冻干燥保存于2〜8C,取出时溶解后，保存于2〜8C,至少一个月内可保持稳定。腹水抗体也可冷冻干燥低温(4C)保存两年，融化后放置4C下保存一个月。短期使用的腹水抗体，4C3〜4个月仍保持稳定，培养上清加0.1%NaN3,贮于-20C，两年不失活性。生产单克隆抗体的杂交瘤技术将经预定抗原免疫的淋巴细胞与失去次黄嘌吟磷酸糖转移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)合成能力的骨髓瘤细胞系细胞融合，产生杂交瘤细胞，经过培养、筛选和克隆化，获得既能分泌针对预定抗原的单抗又能无限制增殖的杂瘤细胞系，这就是淋巴细胞杂交瘤技术。杂交瘤技术的原理杂交瘤技术的原理可用(图2)来说明。图中的A为用预定抗原免疫的小鼠的脾淋巴细胞，B为HGPRT或TK小鼠骨髓瘤细胞，两者在融合剂聚乙二醇存在时进行融合。发生融合作用后的细胞混合物在含有次黄嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的选择性培养基(HAT)中培养。PEGi 相便融 i 相便融 I柚计人合的A“響礎含相互楹HAT选择含堆莽液中塔•蒂r*t I ti培养中占绝对优势的是未融合的A和未融合的B,有少数的A和B融合以及其少数的A-A融合和B-B融合。未融合的A和少数的A-A融合，畑有完整的DNA代谢系统，但因其本身是不能连续培养的短寿细胞，故很快死亡；未融合的B和少量的B-B融合，因其为TK或HGPRT的缺陷细胞，在HAT培养基中DNA代谢被完全阻断，亦很快死亡；只有少量的A和B融合产生的杂交瘤细胞，因得到来自脾淋巴细胞的DNA代谢旁路酶系统和来自骨髓瘤细胞的连续培养特性的互补作用，而存

活迅速增殖。有些杂交瘤细胞来自分泌针对预定抗原体的B淋巴细胞，通过筛选（抗体检测）和克隆化，即可建立生产单抗的杂交瘤细胞系。杂交瘤技术的程序用杂交瘤技术制备单抗的主要程序如（图3）所示，包括动物免疫，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选和克隆化，单抗的鉴定等步骤。看tap细-看tap细-亘斥茫討定Nt富7T=厂廷扌石空上学旳护天了聲*}3.2.1动物免疫：需的单抗，但疫抗原可提高杂交瘤的阳性率，尽可能将免疫抗原提纯。免疫动体分泌能力较稳定。免需的单抗，但疫抗原可提高杂交瘤的阳性率，尽可能将免疫抗原提纯。免疫动体分泌能力较稳定。免大大减轻筛选的工作量。所以应根据具体的抗原和实£物以BALB/C小鼠最常用，因大多数小鼠骨髓细胞源于该系，疫程序直接影响融合率和杂交瘤细胞的阳性率，应考虑抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的使用及动物对该抗原的免疫应答能力等。如希望得到针对非优势决定簇的单抗，或针对各种不同表位的单抗，则不宜作多次免疫。一般最后一次免疫取腹腔或静脉途径，3天后融合。细胞融合免疫小鼠脾脏淋巴细胞和骨髓瘤细胞在PEG的促使下融合。影响细胞融合的因素很多，最重要的有骨髓细胞、聚乙二醇（PEG）培养基和培养条件。骨髓瘤细胞和有枝原体污染则不能产生杂交瘤。融合一周时间内使骨髓瘤细胞一直处于对数生长的良好状态是融合成功的关键之一。不同厂家和不同批次的PEG融合率差异很大，一般用分子的相对质量1000〜4000的PEG,工作浓度40%〜50%,pH8.0〜8.2，作用时间1〜2min，杂交瘤细胞最适宜的条件是37°C,5%〜8%吃CO2，95%饱和湿度，细胞融合前应将co2孵箱调至最佳工作状态。杂交瘤细胞筛选即把分泌针对预定抗原的抗体杂交瘤细胞筛选出来，通常亦称抗体检测，筛选杂交瘤的抗体检测方法必须具有快速、准确、简便以及一次能处理大量样品的特点，因为往往需要在几个小时内报告几百个样品的检测结果。一般说应在融合之前建立好抗体检测方法，并克服可能存在的问题。在设计检测试验时充分认识到单抗与多抗不同，用一种试验筛选出来的单抗，在不同类型的其它试验中可能没有反应，因此筛选的方法必须与单抗的最终用途相符合。杂交瘤细胞的克隆化所谓克隆化是指通过体外培养从混合细胞群体中得到单个细胞无性繁殖的群体。从原始孔中得到的分泌针对预定抗原的杂交瘤细胞可能不是单克隆性的，因此它们分泌的抗体不一定是同质的。为了得到完全同质的单抗，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。另一方面，杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能已丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已不再分泌抗体的细胞，得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞群体（又称亚克隆），也需要克隆化。此外，在液氮中长期冻存的杂交瘤细胞，复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失，这时也需要克隆化。初次检出阳性杂交瘤孔，一般连续进行2~3次克隆化即可，有时则需要进行多次。克隆化以有限烯释法最为常用。单抗的鉴定为了正确使用单抗，在建株时应对每种单抗与相应抗原的反应性、单克隆性和理化特性等进行鉴定。与相应抗原的反应性鉴定，包括确定单抗所针对的抗原表位，确定单抗的特异性和交叉反应性，确定单抗在不同免疫学试验中的反应性。单克隆鉴定包括确定单抗重链和轻链类型，确定杂交瘤细胞染色体数目和确定单抗的纯度。理化特性鉴定的主要内容是单抗对温度和pH值变化的稳定性，以及单抗的亲和力，它们可为单抗的正确保存和使用提供依据。单抗的制备分泌特异单抗的杂交瘤细胞系在建立后通常冻存于液氮中，可随时取出复苏，用于制备单抗。在实验室少量制备单抗，通常用细胞培养法和激化BALB/C小鼠接种法。杂交瘤细胞不是严格的贴壁依赖细胞，它既可以进行单层细胞培养，又可进行悬浮培养。单层细胞培养是制备单抗最常用的实验室方法，因能达到的细胞密度极限为1〜2X106/ml培养上清中的单抗浓度仅10〜50ug/ml。用小鼠接种法制备单抗，先将BALB/C小鼠用降植烷或液体石蜡激化0.3ml/只腹腔注射），间隔7〜10天后腹腔接种杂交瘤细胞2〜5X105/只，再间隔5〜7天采集腹水。通常每只小鼠可采5〜10ml腹水，抗体含量在1〜5mg/ml左右。单克隆抗体的应用领域单克隆抗体在临床上的应用单克隆抗体用于临床诊断和治疗，目前研究较多的是抗人T细胞单克隆抗体，用以识别人T细胞表面的不同抗原决定簇，有OKT系统及Leu系统。T细胞，特别是免疫调节T细胞（Ti/h及Tc/s细胞）对于调控免疫应答和维持免疫自稳起着至关重要的作用,临床上许多疾病的发生与免疫调节失常有关，因此，研究T细胞在这些疾病中的变化，有助于探讨病因和辅助诊断。各种免疫缺损病、肿瘤或感染性疾病都与免疫功能低下有关，而变态反应性疾病、自身免疫性疾病等与免疫功能亢进有关。因此应用0KT系列单克隆抗体检测这些疾病患者外周血中T细胞亚群及T4/T8比值的变化，对探讨发病机理，及时诊断疾病及监测病情发展有十分重要的意义。接受肾移植或骨髓移植的患者往往需应用各种免疫抑制剂以控制排斥反应，T细胞亚群的检测有助于了解移植器官的排异和发展。抗人T细胞单克隆抗体可用以治疗白血病、移植物抗宿主反应（GVHD）和急性肾排斥等，目前尚处于摸索阶段。单克隆抗体在食品中的应用单克隆抗体可辨认抗原物质结构的微细差异，并和抗原发生特异性结合，用免疫分析技术能精确地测定抗原物质的含量。单克隆抗体在食品中的应用已在食品加工生产以及科学研究中得到广泛的应用。有关方面包括食品的成分，食品生产和加工，食品安全性以及食品成分在加工前后的分子水平上变化及其加工特性。单克隆抗体在乳品工业中的应用单克隆抗体在乳品工业中主要用于牛奶份分析；形成牛奶正常和非正常风味的微生物与酶的鉴定；牛奶中的病原微生物和毒素的检测；加工工艺对牛奶蛋白结构的影响以及牛奶中掺杂羊奶的识别。在牛奶中掺杂羊奶会严重影响乳酪的加工，因为牛奶凝块的组成将影响产品的感官品质和加工特性。根据不同动物的免疫反应不同，一种以抗牛奶酪蛋白的专一性抗体进行的免疫斑点技术被建立。而且由于酪蛋白的耐热性，这种方法对巴氏杀菌前后的牛奶或乳酪都能进行分析。单克隆抗体在酿酒工业中的应用啤酒麦芽是啤酒的主要成分，用单克隆抗体可监测大麦发芽和酿造过程的特性。此外，可用于检出有害野生酵母以及各种途径的污染物。一种热稳定蛋白被认为对啤酒的泡沫稳定性起着重要的作用，它在整个啤酒酿造过程中保持着抗原性，能被抗体认别；用ELISA研究了麦芽制备、烘干、和捣碎过程对一种a-淀粉酶抑制剂BASI的抗原性的影响，发现制备过程对其只有很小的影响，烘干使其抗原性部分受损，而残存的抗原性在50〜70°C捣碎过程中几乎全部丧失；用免疫扩散技术鉴定了三种与起泡有关的蛋白，而且观察到这些蛋白在煮沸时明显减少。葡萄酒葡萄酒的生产依赖于两个方面：葡萄的生产和葡萄的发酵。单克隆抗体已被用于诊断两种主要危害葡萄酒的病毒GVF和AMV。要检出发酵菌种中污染的野生酵母时，以胞壁特异性的多糖和蛋白质为抗原制备成抗体的免疫学方法比电泳更快速、灵敏地检出污染酵母。4.3单克隆抗体在肉品卫生中的应用肉品卫生检验是免疫学技术应用的一个重要方面。沙门氏菌是肉品污染中一种典型的病原微生物。目前出现的许多快速检测方法是利用酶免疫(EIA)方法。包括直接EIA夹心ELASA等。最新的检测方法是采用特殊材料制成固相载体，聚酯布(Po-tyestercloth)结合单抗放置在层析柱的底部富集鼠伤寒沙门氏菌，然后直接做斑点印迹试验；还有用单抗结合到磁性粒子(直径上28nm)，用来检测卵黄中的肠炎沙门氏菌，英国biomerienx公司最新推出了一种全自动ELASA沙门氏检测系统，其原理是将捕捉抗体包被到凹形金属片的内面上，吸附被检样中的沙门氏菌。仅需把样品加到测定试剂孔中，其余全部为自动分析，仅45分钟，比传统的方法省时、方便。4.4.单克隆抗体在食品储藏中的应用食品在储藏过程中会受到霉菌等微生物的污染，其结果不仅导致感官品质和营养价值的降低，更重要的是某些霉菌能产生毒素。对霉菌的检测一般采用培养、电导测量、测定耐热物质如几丁质以及显微观察等，均繁琐而费时，现在已从青霉、毛霉等霉菌中提取耐热性抗原制成抗体。用ELASA方法可检出加热和未加热的食品中的霉菌。黄曲霉素致癌、致突变物。对这种真菌毒素的免疫学分析方法有放射免疫分析(RIA)和酶联免疫吸附分析等。新一代ELASA引入一系列放大机制，使ELASA敏感性大为提高，如底物循环放大机制，使碱性磷酸酶不直接催化有色物质生成，而是使NADP脱磷酸生成NAD,NAD进入由醇脱氢酶和黄素酶催化的氧化还原循环，导致有色物质的生成，这种放大机制使碱性磷酸酶的信号比标准ELASA放大了250倍。一种专一的竞争ELASA微量试验碟已被用于检出黄曲霉素B1、B2