FFPE样本单细胞转录组与空间转录组的解决方案

———FFPE样本单细胞转录组与空间转录组的解决方案

FFPE（formalinfixationandparaffinembedding）样本，即福尔马林固定石蜡包埋的组织样本。它承载了众多疾病的关键信息，又可长期室温保存，所以是病理科当之无愧的"瑰宝'。在世界范围内，大约有数十亿份组织样品存储在医院或生物样本库中，其中绝大多数是FFPE样本。

但是，FFPE样本也因为福尔马林的固定容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程进一步加速核酸的降解，保存的时间及环境对样品中的核酸也有巨大的影响。

因此，从FFPE样本中提取出高质量核酸，并构建出信息完整、无偏好、可用于后续各类组学研究的文库，则是"大大'的难题。

目前，针对FFPE样本，10xGenomics已有单细胞转录组和空间转录组解决方案，了解这些前沿技术，助力您全方位解锁FFPE样本中蕴含的宝贵信息。

图1FFPE样本可用的前沿技术

一FFPE样本单细胞转录组测序

1.1实验原理

针对FFPE切片，使用二甲苯脱蜡；使用胶原酶、胰蛋白酶等多种酶来消化组织，制备单细胞悬浮液，进而抽核得到细胞核样本；建库时采用靶向基因的探针对杂交目标RNA分子后连接的原理，进而完成文库构建的过程；该方法可以用来分析数千个至数万个细胞核的基因表达，可检测出人类或小鼠全转录组，尤其是低表达量的基因。

1.2实验所需10x设备-ChromiumX

ChromiumX相当灵活，适合任何实验室，能够在单次运行中分析数百至数十万个细胞，让百万级的细胞研究变得常规。

FFPE单细胞转录组油包水制备过程是在ChromiumX设备当中进行的，运行时间仅需5.5min，运行温度要求18-28℃，运行湿度要求30-80%相对湿度。

图2油包水生成示意图

图3油包水制备过程仪器界面图

1.3技术流程图

图4FFPE样本单细胞转录组实验流程图

1.4样本要求：

由于受蜡块年龄、组织类型、固定前组织质量、组织密度、组织面积以及其它因素的影响，致使相同面积和厚度的组织解离后获取的细胞数量也存在较大差异。

对于人和小鼠的组织切片要求详细如下：

人组织：建议每张切片厚度25um，每2张切片放入1个1.5mL无核酸酶离心管中，建议多准备1-2管备用。

小鼠组织：建议每张切片厚度50um，每2张切片放入1个1.5mL无核酸酶离心管中，建议多准备1-2管备用。

FFPE组织质量要求DV20230%。

以下列出了10xGenomics公司已测试的FFPE组织切片，以及解离后单细胞悬浮液的细胞产量。参考该测试数据，可以估计特定组织类型/切片的近似细胞产量。

二VisiumCytAssist空间转录组测序

2.1带您认识VisiumCytAssist

全新的VisiumCytAssist是一款小巧的台式仪器。能够将转录组分析物从标准的载玻片转移到Visium玻片上，便于您从更多种类的样本中获得空间分析的见解。CytAssist仪器与苏木精-伊红（HE）染色或免疫荧光（IF）染色的FFPE组织切片兼容，让预先以切片形式保存的组织也能用于Visium工作流程。您可以通过标准的组织学技术筛选组织切片，找到有生物学意义的切片，然后用CytAssist仪器将这些切片与Visium玻片的捕获区域精确对齐，从而最大限度发挥Visium实验的作用。图5VisiumCytAssist-空间组学组织分析物转移系统

2.2技术流程图

图6基于VisiumCytAssist的FFPE空间转录组测序流程图

2.3样本要求：

2.3.1样本类型

①常规HE染色的FFPE切片

②FFPE组织蜡块

2.3.2RNA质量

提取FFPE切片中总RNA，质检DV200，要求DV20230%。

2.3.3组织大小

根据要研究的组织区域大小，提供6.5mmx6.5mm或11mmx11mm两种空间转录组玻片供选择。

2.4载玻片要求：

标准载玻片规格为25x75mm，由于不同厂家规格存在差异，可用于VisiumCytAssist平台的载玻片最小规格为24.8x74.4mm，最大规格为25.3x76.2mm。图7可用于VisiumCytAssist的4种载玻片

2.5贴片要求：

组织需张贴在不同规