测序技术介绍

测序技术介绍第1页/共72页测序技术发展史第2页/共72页一代测序1954年，Whitfeld等用化学降解法测定多聚核糖核苷酸序列，是关于DNA测序技术的较早报道。1977年，Sanger发明DNA双脱氧核苷酸末端终止测序法（chainterminatorsequencing），A.M.Maxam和W.Gilbert发明DNA化学降解测序法(chemicaldegradationsequencing)，2项技术的出现，标志第1代测序技术诞生。第3页/共72页Sanger测序法的原理每一次DNA测序反应都由4个独立反应组成；由于DNA双链中核苷酸以3′，5′-磷酸二酯键相连，因此在测序过程中掺入2′，3′-双脱氧核苷三磷酸———ddNTP（不含3′-OH），当ddNTP位于DNA双链的延伸末端时，无羟基3′端不能与其他脱氧核苷酸形成3′，5′-磷酸二酯键，因此，DNA双链合成便终止；若在终止位点掺入ddATP，则新生链末端为A，若掺入ddTTP、ddCTP、ddGTP，相应地，新生链末端则是T、C或G。第4页/共72页第5页/共72页第6页/共72页第7页/共72页第8页/共72页该测序技术的具体做法如下：将模板、引物、4种dNTP（其中含有一种为放射性同位素标记的核苷酸）与DNA聚合酶共同保温，形成的混合物包含许多长短不一的片段，最后利用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳（SDS）分离该混合物，得到放射性同位素自显影条带图谱，人们依据凝胶电泳图即可读出DNA双链的碱基序列组成。第9页/共72页第10页/共72页第11页/共72页第12页/共72页自动化测序实际上已成为当今dna序列分析的主流。美国PEABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等dna测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。第13页/共72页测序过程中的常见问题分析在进行DNA测序时，紧接引物的10—30Bases有时不一定能完全读清楚。由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中途无法进行之情况。如：G/Crich;G/CCluster；PolyA、PolyT的连续结构等。此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有二个以上的结合位点。具体问题分析如下：1：测序结果有很多套峰，出现很多N值原因分析：PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。

在序列的起始端出现N值，主要是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰，是机器无法正确判读出位何值。有时，引物二聚体或者起始端小片段的丢失，也会出现N值。模版本身含杂合序列，有等位基因。第14页/共72页测序过程中的常见问题分析2：为什么找不到我的PCR引物序列？用PCR引物作为测序引物，所测序列是从引物3末端后第一个碱基开始的，所以就找不到您的测序引物了。可以进行反向测序，得到引物的反向互补序列。还可以将所测片段克隆到适当载体中，由于通用引物与插入序列有一段距离，就可以测出您的引物序列。3：测序结果和文献资料不一样，为什么?原因有很多，如同一种动物，在不同的种族之间，或者不同的个体之间，基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序,那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果，不能保证和文献序列完全一致。4：过短的PCR产物为什么不适于直接测序？首先由于一般的PCR产物纯化试剂盒要求产物片段大于200bp,过短的PCR产物不能进行纯化；再者，测序的前50bp和后50bp的序列是不好的，所以不适于直接测序。第15页/共72页测序过程中的常见问题分析5：酒精如果没有挥发完全,在约300bp处会出现连续异常的G峰，酒精挥发时间过长会导致DNA断裂。第一个峰，重叠干扰。如果不判读为干扰峰，那就说明样品不纯，如果是基因组DNA，就很好地说明了样品为杂合子，该位点可能存在SNP现象（T/G）。如果判读为干扰峰，我们只需认定样品此处碱基为T为行了。第二个峰，错位干扰。如果不判读为干扰峰，则说明样本可能比预期多一个碱基（G），如果判读为干扰峰，我们仍只需认定样品此处碱基为T为行了。第16页/共72页测序过程中的常见问题分析6：为什么用PCR产物或质粒测序时，经常会出现套峰现象?下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即模板中含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。解决办法：重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。第17页/共72页测序过程中的常见问题分析7：poly结构的测序结果以polyT为例，在polyA/T结构之后往往出现移码现象，而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减。解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。第18页/共72页第二代测序技术（Next-GenerationSequencing）第19页/共72页各自的优点454测序平台得到的片段能够达到400bp，并且读长的质量高；Solexa测序平台的性价比最高，在数据量相同的情况下，测序成本仅为454测序平台的1/10；SOLiD测序平台准确度能够达到99.94%，在片段覆盖率为15×时，测序准确度可接近100%。第20页/共72页2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——GenomeSequencer20System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GSFLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（basepair），且准确率达到99%以上。2008年，GSFLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。虽然454GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（denovo）和宏基因组测序（metagenome）方面有着不可替代的地位。第21页/共72页2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系统——GenomeAnalyzer，简称GA。这套基于DNA簇（DNAcluster）、桥式PCR（BridgePCR）和可逆阻断（Reversibleterminator）等核心技术的系统具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。2007年，Illumina公司以6亿美元的高价收购了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次运行可获得1Gb的数据，因此也有1GbAnalyzer的含义，而最新的Hiseq2000平台则能够在10天的运行中获得300Gb以上的数据，读取的碱基长度达到150bp左右。更有消息称，Illumina已完成了600Gb的运行测试并在部分客户中开展了前期体验，Tb（1000Gb）级的测试Run也将于年内进行。据不完全统计，Illumina公司已售出超过600台/套GAIIx和Hiseq2000平台，2010年仅深圳华大基因研究院一家就购买了128台Hiseq2000，一举成为全球最大的基因组测序与分析中心，Illumina公司在测序领域的影响力由此可见一斑。第22页/共72页在Sanger测序时代，美国应用生物系统公司（ABI）一直是该行业的龙头老大，其垄断地位无人能撼，从早期的377到全自动化的3730xl，ABI的测序仪被广泛应用在基因组学研究的各个方面。然而在第二代测序技术迅猛发展之初，ABI起步较晚，显得有些漫不经心。直到2005年454公司推出GS平台，ABI的领先地位受到威胁，这才开始发力，迅速收购了研发NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD测序平台。此后SOLiD不断升级，目前已到SOLiD5版本（SOLiD5500xl）。SOLiD的全称是SequencingbyOligoLigationDetection，即寡聚物连接检测测序，其基本原理是通过荧光标记的8碱基单链DNA探针与模板配对连接，发出不同的荧光信号，从而读取目标序列的碱基排列顺序。在该方法下，目标序列的所有碱基都被读取了两遍，因此SOLiD最大的优势就是它的高准确率。据悉，SOLiD5平台的测序通量已达到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，准确率高达99.99%。并且由于SOLiD系统采用的不是PCR反应进行DNA合成与测序，因此对于高GC含量的样本，SOLiD系统具有非常大的优势。第23页/共72页2023/4/16454测序原理焦磷酸测序法（Pyrosequencing)的原理第24页/共72页2023/4/16454测序原理焦磷酸测序法（Pyrosequencing)的原理第25页/共72页2023/4/16454测序原理焦磷酸测序法（Pyrosequencing)的原理第26页/共72页2023/4/16454测序原理在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。454测序仪的整个实验步骤可大致概括为：样品处理文库制备emPCR反应板准备上机测序第27页/共72页2023/4/16454测序原理样品处理：样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。第28页/共72页2023/4/16454测序原理文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。经过磁珠结合与DNA变性之后，只有A+目的片段+B形式的连接产物得以富集，另两种形式（AA、BB）的产物都被去除。第29页/共72页2023/4/16454测序原理emPCR（乳液PCR)是454测序的一个关键步骤，将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器（microreactor）中将只包含一个磁珠和一条单链DNA，通过控制该步骤的条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。经过PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段依然结合在磁珠上。第30页/共72页2023/4/16454测序原理454测序的反应板称为PTP（PicoTiterPlate），含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29μm，而测序磁珠的直径为20μm，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。将磁珠与测序试剂加入PTP中，使之可用于上机测序。第31页/共72页2023/4/16454测序原理测序步骤如前所述，四种碱基在泵的控制下依次加入反应板，反应完成后再洗去，每延伸一个或若干个碱基，就会发出一次光信号，通过记录信号的有无和强度，即可测定DNA序列。第32页/共72页2023/4/16第33页/共72页2023/4/16454测序原理优缺点：454测序准确度较高，当读长超过400bp时，其准确性仍能达到99%以上；主要的错误来自于同聚物，即相同碱基的连续延伸，如ATTTG这样一段序列，A和G的读取没有问题，但T只记录了一次光信号，仅信号强度与ATG序列的T有所不同，因此同聚物越长，可能产生的误差就越大。目前，由于454测序仪在读长上的明显优势，它在大基因组从头测序（denovo）、转录组分析、基因组结构分析等领域有着广泛的应用。第34页/共72页Solexa测序2023/4/16第35页/共72页Solexa测序2023/4/16常用术语：SBS：边合成边测序反应，每次SBS会延伸一个碱基，大约耗时70分钟。Run：单次上机测序反应，可以产生4G-75G测序通量不等。Lane：单泳道，每条泳道可以直接物理区分测序样品，1次run最多可以同时上样8条Lane。Channel：Lane的同义词。Tile：小区，每条Lane中排有2列tile，合计120个小区。每个小区上分布数目繁多的簇结合位点。Cluster：簇，在Solexa测序技术中会采用桥式PCR方式生产DNA簇，每个DNA簇才能产生亮度达到CCD可以分辨的荧光点。第36页/共72页Solexa测序2023/4/16Index：标签，在Solexa多重测序（MultiplexedSequencing）过程中会使用Index来区分样品，并在常规测序完成后，针对Index部分额外进行7个循环的测序，通过Index的识别，可以在1条Lane中区分12种不同的样品。Barcode:

Index同义词Fasta：一种序列存储格式。一个序列文件若以FASTA格式存储，则每一条序列的第一行以“>”开头，而跟随“>”的是序列的ID号（即唯一的标识符）及对该序列的描述信息；第二行开始是序列内容，序列短于61nt的，则一行排列完；序列长于61nt的，则每行存储61nt，最后剩下小于61nt的，在最后一行排列完；第二条序列另起一行，仍然由“>”和序列的ID号开始，以此类推。第37页/共72页Solexa测序2023/4/16Fastq：Fastq是Solexa测序技术中一种反映测序序列的碱基质量的文件格式。第一行以“@”符号开头，后面紧跟一个序列的描述信息；第二行是该序列的内容；第三行以“+”符号开头，后面紧跟的内容与第一行一样，同样是该序列的描述信息；而第四行是第二行中的序列内容每个碱基所对应的测序质量值。PF%：PF%是指符合测序质量标准的簇的百分比（MultiplexedSequencing），与测序的通量相关联。Read：Solexa是成簇反应的，每个簇对应一条DNA序列片段，成为一个read。第38页/共72页Solexa测序2023/4/16第39页/共72页Solexa测序2023/4/16第40页/共72页Solexa测序2023/4/16第41页/共72页Solexa测序2023/4/16第42页/共72页Solexa测序2023/4/16第43页/共72页Solexa测序2023/4/16第44页/共72页Solexa测序2023/4/16第45页/共72页Solexa测序2023/4/16第46页/共72页Solexa测序2023/4/16应用：

Solexa平台的应用范围极广，几乎囊括了目前基因组学研究的所有方面，例如基因组从头测序（denovo）、重测序（re-sequencing）、基因组结构分析、转录组测序、表达谱分析、小RNA及非编码RNA测序、表观遗传学研究等等。第47页/共72页SOLiD测序2023/4/16第48页/共72页SOLiD测序2023/4/16第49页/共72页SOLiD测序2023/4/16第50页/共72页SOLiD测序2023/4/16第51页/共72页SOLiD测序2023/4/16第52页/共72页SOLiD测序2023/4/16第53页/共72页SOLiD测序2023/4/16第54页/共72页SOLiD测序2023/4/16第55页/共72页SOLiD测序2023/4/16第56页/共72页SOLiD测序2023/4/16第57页/共72页SOLiD测序2023/4/16第58页/共72页SOLiD测序2023/4/16第59页/共72页SOLiD测序2023/4/16第60页/共72页SOLiD测序2023/4/16第61页/共72页SOLiD测序2023/4/16第62页/共72页SOLiD测序2023/4/16第63页/共72页三者比较Ｒｏｃｈｅ／４５４测序技术读取长度（６００～１０００ｂｐ），在３种测序技术中最长，可以对未知基因组进行从头测序，但其通量最低（０．５～１Ｇｂ／ｒｕｎ）。当遇到ｐｏｌｙｍｅｒ（如ＡＡＡＡＡＡ等）时，碱基个数和荧光信号强度不成线性关系，即判断重复碱基有困难。2023/4/16第64页/共72页三者比较Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ属于高度自动化的系统，读取片段比其它种类的测序多，适合进行大量小片段的测序（如ｍｉｃｒｏＲＮＡｐｒｏｆｉｌｉｎｇ），其测序通量大，其新机型Ｈｉｓｅｑ２０００产出量为６００Ｇｂ／ｒｕｎ，但基于可逆反应时随反应轮数增加效率降低、信号减弱，并且读长（通常为１００ｂｐ）比Ｒｏｃｈｅ／４５４短，给从头测序拼接带来困难。2023/4/16第65页/共72页三者比较ＡＢＩ／ＳＯＬｉＤ技术每个碱基读取２次，有非常高的准确性，特别是针对ＳＮＰ的检测。此外，灵活的系统和完善的磁珠编码系统可以进行样品的ｐｏｏｌｉｎｇ来分割测序区域，特别适用于具有高质量参考基因组序列物种的重测序，但是该测序读长（５０ｂｐ）最短，并且读取长度受反应轮数的限制，给从头测序拼接带来困难。2023/4/16第66页/共72页第三代测序技术原理：脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA