流式细胞术在科研中的应用描述

流式细胞术在科研中的应用描述第1页/共55页

流式细胞术在科研中的应用

第2页/共55页什么是流式细胞仪●流式细胞仪实物BDFACSVantageBD-Calibur第3页/共55页流式细胞仪可检测到的细胞参数

非荧光信号颗粒度细胞大小前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积

侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性第4页/共55页外周全血细胞散射光双参数点图第5页/共55页荧光信号荧光强度（FL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）高FL细胞与低FL细胞区分开来（强弱）一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源（488nm、633nm和325nm），可测出6个FL。第6页/共55页荧光信号双色直接染色第7页/共55页流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。几个概念：%Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。Mean：平均荧光强度，与被检测物质的表达量有关，在正态分布时一般用该值。GeoMean：几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。第8页/共55页散点图

密度图二维等高图直方图图报告中常见的几种流式细胞图第9页/共55页图AnnexinV/PI双标记分析细胞凋亡和坏死第10页/共55页流式细胞仪数据分析点图分析第11页/共55页流式细胞仪数据分析直方图分析第12页/共55页图中100～101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞第13页/共55页当前流式细胞分析发展趋势从相对细胞计数到绝对细胞计数从相对定量到绝对定量分析从单色到多色荧光分析从细胞膜成分到细胞内成分分析从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析第14页/共55页今天主要内容：流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用流式细胞术在肿瘤细胞DNA倍体中的应用流式细胞仪的分选功能流式细胞术在蛋白检测中的应用第15页/共55页细胞凋亡检测第16页/共55页1、半胱氨酸蛋白酶3检测法（早早期）2、AnnexinV-FITC/PI法（早期）3、Apo2.7检测法（早期）4、TUNEL法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、细胞凋亡相关蛋白的流式细胞术检测流式细胞术检测细胞凋亡第17页/共55页细胞凋亡的分析细胞凋亡的主要表现细胞内水解酶改变：如Caspase-3活化细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相关蛋白：FasBcl-2第18页/共55页细胞凋亡——ActiveCaspases-3第19页/共55页细胞凋亡——Caspases-3第20页/共55页细胞凋亡——AnnexinⅤ第21页/共55页凋亡检测（AnnexinV/PI法）

PIAnnexinV-FITC第22页/共55页DNA倍体的流式分析第23页/共55页细胞DNA含量检测细胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。

第24页/共55页第25页/共55页单参数直方图图中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图第26页/共55页DNA细胞周期分析细胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量细胞数量2N4N

第27页/共55页第28页/共55页2倍体异倍体4倍体肿瘤组织中的各种DNA倍体第29页/共55页含量与凋亡关系DNA亚G1峰的检测：利用PI染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。第30页/共55页第31页/共55页第32页/共55页Dateacquired:14-Jan-03File:7Gy4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%DipG0-G1:73.12%at48.16DipG2-M:9.59%at96.33DipS:17.29%G2/G1:2.00Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48

图FCM测试细胞周期分布和凋亡第33页/共55页流式细胞仪的细胞分选功能第34页/共55页分选：用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般分选速度为每秒钟300个细胞，大型机分选速度可达到每秒上万个细胞第35页/共55页488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector第36页/共55页流式分选与分子生物学研究除了将分选得到的细胞进行后续培养研究外，FCM分选系统可为PCR、FISH等分子技术提供纯度较高的特异性细胞群，减少研究中的干扰因素，获得更准确的实验结果。第37页/共55页CytometricBeadsArray(CBA)

流式液相多重蛋白

定量技术第38页/共55页导言常规的蛋白分析方法：ELISA：一次反应只能检测一个指标Westernblot：不能对蛋白精确定量不足之处：检测多个指标需耗费大量样本分批操作导致组间差异大操作繁琐，耗时耗力如何能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，获得高精确度的数据呢？针对于此，BD-Pharmingen成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多重蛋白定量技术——BDCytometricBeadArray，简称CBA

第39页/共55页CBA技术简介CBA是一系列带有不同强度红色荧光、包被有捕获抗体的微球，类似ELISA的捕获孔板，可以捕获液相样本（血清、血浆或者细胞培养上清液等）中相应的抗原，再结合PE标记检测抗体，形成双抗体夹心结构，通过流式细胞仪进行荧光检测，便可同时对样本中的多种可溶性蛋白成分进行定量++AnalyteofinterestFluorescentdetectionAb

captureBead

captureAbBead第40页/共55页BDCytometricBeadArray123不同强度红色荧光的捕获微球，在FCMFL3检测不同的目标蛋白PE标记的检测抗体，在FCMFL2检测。PE的荧光强度即反映靶蛋白的含量456第41页/共55页HumanTh1/Th2LymphokineCBATh1/Th2panel:IL2,IL4,IL5,IL10,TNF,IFN用

FL3荧光的强度不同区别种不同的微球（beads）DirectsandwichimmunoassayFL2(PE)detectorreagent样本处理6cytokinesfroma50Lsample

Threepipettingsteps 3hourtotalincubation QuantitativeresultsandcompletereportgenerationSoftwareassistedquantitativeanalysis,withcurvefittingalgorithmResultreportingincludedinsoftware第42页/共55页HumanTh1/Th2LymphokineCBA第43页/共55页

Chemokine-ICBAAssayStandard0pg/mlCBAAssayStandard第44页/共55页10pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第45页/共55页20pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第46页/共55页40pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第47页/共55页80pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第48页/共55页156pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第49页/共55页312pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第50页/共55页625pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第51页/共55页1250pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第52页/共55页2500pg/mlCBAAssayStandardcont.Che