理工类专业课复习资料-分子遗传学要点整理

1Transcriptomesand1.概述基因组(Genom：指生物的整套染色体所含有的全部DNA或RNA序列。基因基因组学(Genomics)：指研究生物的整个基因组，涉及基因组作图、测序和要酶及其他参与基因组表达过程中一系那些决定细胞能够进行生1GenesaremadeofDNA证明基因由核酸(DNA或RNA)组成的3个著名实验：DNA质2ThestructureofDNAA.Nucleotidesandpolynucleotideslehelixa.WatsonandCrick(1953)提出的"?螺旋中相邻碱基间相隔0.34nm，每10个碱基对螺旋上升一圈，螺距为nm，直径为2.37nm。尽管氢键使得双链中的碱基间的配对具有特异性 ，的疏水堆积力。作为芳香族化合物，2效应使双链DNA成为能量上最为稳定的结构。尽管这种堆积作用在RNA中也存c.DNA双螺旋结构的类型:nscriptome、1.?稳定性差2.?主要以单链形式存在.2细胞内的RNA组分(mRNA/rRNA/tRNA)RNAsnoRNA的核仁区，在rRNA分子的加工过程中起到核心作用(比如在某个核苷酸位点上加上一个甲基)。AProcessingofprecursorRNA末端修饰/剪接/剪切/化学修饰iptomeRNA是细胞中最重要的组分，因为它包转录组从不从头合成(denovo)，一个细胞通过细胞分裂诞生时就接收了其mRNA基因的表达来改变转录组的组3.5转录组研究的方法A.通过序列分析研究转录组2)基因表达系列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)表了转录组中存在的一种mRNA。mRNA。收集起来，头尾相连以产生一个串联体，进行测序分析。哪些基因被转录，表达水平如何。B.通过微阵列或芯片分析来研究转录组ProteinsandtheProteomeProteinstructure氨基酸形成的多聚体或多肽在长度上很少超过2000个单位。a.primarystructure氨基酸通过肽键连接成一条多肽链。b.secondarystructure指多肽采取的不同构象，由不同氨基酸之间形成的氢键所稳定。α螺旋；β片层c.tertiarystructure是将多肽链的二级结构组分折叠成为三维构型而形成；半胱氨酸残基间的二硫键d.quaternarystructure两条或更多已形成三级结构的多肽链组合在一起形稳定力包括：二硫键(稳定)；氢键，疏水作用(松散)B.蛋白质的多样性取决于氨基酸的多样性非极性(疏水)极性(亲水)带负电荷带正电荷2TheproteomeA.ThelinkbetweenthetranscriptomeandtheproteomeB.蛋白质组和细胞生化功能之间的联系生物催化作用(酶)；4结构(细胞骨架由蛋白质决定)；运动(收缩蛋白)；运输(血红蛋白运输血液中的氧)；调节细胞进程(信号蛋白、活化调节因子)；保护细胞个体(抗体)；储藏功能(麦醇溶蛋白)。A.蛋白谱(表达蛋白质组学)a.双向电泳：等电点等电点：蛋白质的净电荷为零时溶液的PH值。b.MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)??一旦多肽片段被离子化，多肽的质量/电荷比就可以通过它在质谱仪中从电质量。B.蛋白质印迹法(Western杂交)泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜 (硝酸纤维素膜或尼龙膜)上。然后加入特异性抗体(一抗)，膜上的目的蛋白(抗原)与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗(通带标记化合物(一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，或用同位素或生物素标记)的特异性反应进行检测。物C.鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质量通过鉴定有相互作用的成对或成组的蛋白质能够获得基因组活性相关的构建蛋白质相互作用图谱被视为是连接蛋白质组学与细胞生物化学过程λ噬菌体或某种丝状噬菌体的独特的克隆载体。b.酵母双杂交激活因子(转录因子)：一类控制基因表达的蛋白质，包含DNA结合结构域D质相互作用图谱6udyingDNA。聚合酶链式反应(PCR)以现有DNA或RNA分子为模板合成DNA的酶，称为(依赖模板的)DNA聚合DNA聚合酶I，可获得两个片段，大片段的分子质量约76kDa，保留聚合酶活性和3’-5’外切核酸酶活性，又叫Klenow片A.缺口平移法(Nicktranslation)(DNA聚合酶I)利用PolyI在双链DNA的缺口处进行离体合成。B.末端标记法(Klenow片段)C.随机引物法(Klenow片段)2.2核酸酶：外切核酸酶和内切核酸酶A.限制性内切核酸酶在特定的位置切割DNA分子b.II型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的降解(无修饰酶活性)，且具有专一性，一般在识别序列内切割，不需要ATP7B.检查限制性消化的结果1单位(1U)。DNA接酶端连接的高效率推动了将钝末端转变成粘性末端方法的发展。?一种方法是将称为连接子(linker)或接头(adaptor)的小双链分子连接?另一种方法是利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶进行同聚物加尾，即在钝末端2.4末端修饰酶BDNA端磷酸基团，从而阻止这些分子连接到其他A.以大肠杆菌质粒为基础的载体 pUCkb氨苄青霉素抗性基因(pUC8的选择性标记)和lacZ’基因(编码β-半乳糖苷酶的一部分)。株具有一个修饰的lacZ基因，该基因中缺失lacZ’部分。B.建立在大肠杆菌噬菌体基因组基础上的克隆载体DNA噬菌体上。λ噬菌体基因组大小为48.5kb，其中有15kb为随意区域，可以被删除而λ噬菌体基因组是一个线性分子，但其两个末端具有12个核苷酸的单链突出，cos位点。cos位点序列与λ噬菌体的体外包装密切相关。a).考斯质粒(cosmid)、黏粒具有λcos位点的质粒，与λ噬菌体一样具插入片段可高达44kbb).酵母人工染色体(YAC)YACDNA个选择性标记物，至少一个限制性酶切位点连接起来，酶切位点是为了插入新的DNA，可用来克隆c).细菌人工染色体(BAC)可以通过Lac筛选来鉴定重组体，是目前克隆大片段d).P1噬菌体载体与λ载体相似，以天然噬菌体基因组的缺失形式为P1基因组比λ基因组大，因此能克隆的DNA片段比λkbe).P1衍生的人工染色体(PAC)综合了P1载体和BAC的特点，具有克隆长达300kbf).Fosmids9包含F质粒的复制起始位点和λ载体的cos位点，有出现不稳定问题的ThePolymeraseChainReaction(PCR)1PCR基本原理4.2参与PCR反应体系的因素aryDNA?缓冲液MgTaq关。?dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)10亿倍以上。PCR局限性和应用b.扩增片段的长度。一般扩增长达5kb的片段不会有太大困难，但要扩增更长4.4RT-PCR、污染率低4.5实时荧光定量PCR(FQ-PCR)在这个阶段进行定量分析。CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值(荧光阈值)时所经历的循环数被称为CT值(thresholdvalue)。?实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种。?前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。SYBRGreenIDNA结合染料。?在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠?分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一?分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎?与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。此时荧光4.6反向PCR(inversePCR)反向PCR是对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究的一种简捷方法。1.概述?测序工作中有一个局限性：在一个测序反应中一般只能测出1kb左右的准确otgun(1)全基因组鸟枪法(whole-genomeshotgun)：使用基因组图谱上的显著特征(2)克隆重叠群法(clonecontig)：将基因组打断成长度为数百kb或数个Mb2.遗传图谱和物理图谱3.1基因是首先被利用的标记?最初的遗传图谱是在20世纪初针对果蝇等生物使用基因作为标记构建的。存在，3.2用于遗传学作图的遗传标记?形态标记?细胞学标记?生化标记?DNA分子标记A杂合体A.限制性片段长度多态性 DNA时，在同一种生物的不同个体间出现含同源序B.简单重复序列Simplesequencerepeat,SSR,Microsatellite(微卫星)指重复单位相对较小(2-6bp的基序)，由于重复单位数目的变化而形成的多态记可获得片段的准确长度)ismSNP碱基的差异就称为SNP。aSNP寡核苷酸是在试管中合成的长度小于50bp的DNA分子，寡核苷酸只有与待测Acmb.通过耐扩增突变系统检测SNP(AmplificationRefractoryMutationSystem,R4.物理作图2.遗传图谱的准确率有限NA2)荧光原位杂交(FISH)：将分子标记与完整染色体杂交来确定标记的位置；3)序列标签位点(STS)作图：通过对批量的基因组片段进行PCR和(或)杂交4.1限制性作图(Restrictionmapping)A.限制性作图的基本方法1)双酶解(doubledigest)Key：分析重叠片段比较分析这两种情况下的片段大小。3)末端标记+部分酶解a)利用放射性的同位素标记DNA的3’端或5’端b)部分酶解c)放射自gsitesMCSB.限制性作图的规模受限于限制性片段的大小?限制性作图更适用于小分子。如果DNA分子小于50kb，通常选用6碱基识I(8)。可用该技术构建原核生物和低等真核生物(酵母和真菌)等染色体较小的生DNA提高分辨率?电场转换凝胶电泳(FIGE)?等高加压均匀电场(CHE4.2荧光原位杂交(FISH)A.用荧光探针进行原位杂交?用于原位杂交的探针的标记要同时满足高灵敏度和高分辨率两个条件，非放?现已设计出具有不同发光特性的荧光标记物，可以将一组不同的探针与单个NA一种封闭探针重复序列的方法:如果探针中含有一些重复序列，它可能会和染色B.FISH应用的局限性?使用中期染色体的缺点在于，由于它的高度浓缩的性质，只能进行低分辨率操作较繁琐，数据积累速度太慢。倍，这样分辨率可明显提高，能够区分出相隔200-300kb的标记。?非中期染色体：相比之下，分裂间期的染色体更为有用，因为此时的染色体装程度最低，分辨率有可能达到25kb以下。但染色体形态特征消失，失去了4.3序列标签位点作图(STS作图)?用STS技术绘制物理图是到目前为止最为有效的方法。?STS其实只是基因组中任何单拷贝的短DNA序列，长度在100-500bp，但要?要得到至少5套包含相关染色体或整个基因组的DNA片段(染色体上每一来，从而构建由DNA大片段(YAC/BAC克隆)重叠群组成的物理图谱。A.可以通过以下途径获得STS：S2)简单序列长度多态性(SSLP)：如果将被遗传定位的SSLP用作STS进行们可以在遗传图谱和物理图谱间提供直接联B.用于STS作图的DNA片段群?STS作图必需的第二个要素是覆盖拟研究的染色体或基因组5倍以上的DNA片段群(作图试剂)。?作图试剂可以来自克隆文库和放射杂交体组。a.克隆文库可用于STS分析?基因组计划进入测序阶段的前提是将基因组或分离的染色体断裂成片段，并利用流式细胞计数仪来分离单独的染色体。?克隆文库用于STS作图有一个明显的优势，就是单个克隆即为可提供测序的?来自STS分析的数据既可用作STS作图，又可用于构建克隆重叠群(clonecontig)；?如果STS也包括已遗传定位的SSLP，那么DNA序列、物理图谱和遗传图谱b.放射杂交体组可用于STS分析?放射杂交体：利用高剂量的射线将供体细胞染色体打断成若干小片段，再与?放射杂交作图是基于染色体上的两个STS相距越近其通过断裂分开的频率越?使用PCR方法鉴定STS时，必需保证其只能从供体，而不能从受体基因组中Chapter4SequencingandAnnotationofGenomesA.GenomeSequencing1.1链终止DNA测序法(化学降解法测序、焦磷酸测序)分子区分开。两种形式的聚丙烯酰胺凝胶电泳:平板胶、毛细管胶酸(ddNTP)后，合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生一系列只差一个核苷酸的DNA分子。链终止法测序需要单链DNA模板(3)把DNA克隆到噬菌粒中。噬菌粒是一种质粒克隆载体，除含有自身的复制起点外，还包含来源于M13噬菌体的起始位点。如果大肠杆菌中既有噬菌粒又通过在M13噬菌体载体中克隆获得单链DNA3个标准：P的或没有5’-3’外切核酸酶活性。的或没有3’-5’外切核酸酶活性。wbpDDNA区域链终止法测序所用的不同类型引物:通用引物/内部引物E.热循环法测序代替传统方法学序，产物以线性方式积累，因此DNA在测序前不必克隆，可直接对挖带回收纯化学降解法测序:链终止法测序的一个局限性是：如果模板DNA能形，至少需要进行4个单独的测序反应，每种核苷酸对应 (测2)化学降解法测序?每条链的5’端连接一个放射性的磷基团对DNA进行标记?从凝胶中纯化出一条链后，分成4份样品，每份样品都用一种切割试剂进行处G。起化学发光，发出的荧光信号可以被检测到。在6.4cm2的芯片上可以同时进行2.连续DNA序列的组装(鸟枪法、全基因组鸟枪法和克隆重叠群法)2.1通过鸟枪法拼接序列验中得到的短序列可通过检查重叠区而直接叠加成主要序列。“序列间隙”：可以通过对文库中已经存在的克隆进一步筛选和测序来封闭的A.流感嗜血杆菌序列证实了鸟枪法测序的能力。2.2用克隆重叠群方法组装序列A.可以通过染色体步移来建立克隆重叠群，但该方法费力。贝的非重叠克隆杂交。还可对末端序列进行测序来确保不存在重复DNA。如果末端片段序列已知，可以通过PCR而不是杂交来筛选，这样可以加速步B.更快的克隆重叠群组装方法个克隆的重叠群。Southern杂交所得到的一系列限制性片段进行分析而获得的。复DNA进行PCR之后获得的产物大小可以作为与其他克隆相比较的指纹。S2.3全基因组鸟枪法测序A.全基因组鸟枪法测序的主要特征??鸟枪法测序中最费时的地方是将单个序列重叠群通过封闭序列间隙和物理间??通过使用两种或两种以上的不同载体中所克隆的片段产生的序列能够有效提??序列组装的最初结果是一系列骨架(scaffold)，每个骨架包括一组被序列scaffoldSTS。equences1.在基因组序列中定位基因1.1通过序列筛查定位基因A.基因的编码区是可读框??编码蛋白质的基因含有可读框(OR，可读框包含一系列能规定基因编码蛋白质中氨基酸序列的密码子，并开始于起始密码子(通常是ATG)，结束于终止密码子(TAA,TAG,TGA)。??原因之一是真核生物基因组中基因间的间隔很大，发现假ORF的概率就会增??密码子偏倚(codonbias)被考虑在内。CTGpG??这些功能RNA分子具有它们自己的特征，其中最重要的是它们能折叠形成二RNA如下方法进行定位:??搜寻与功能RNA基因相关的调控序列(前面/内部)。位置”区域，可能会发现一个或多个功能RNA基因的存在。D比较基因组学为序列筛查提供了一个特殊的方向一定程度上可以弥补ORF识别的局限性。??同源性搜索的另一个主要用途是为新基因确定功能。ORF个新定位的ORF在相A1.2基因定位的实验技术A.杂交实验可以判断某一片段是否含有转录序列??通过northern杂交检测有两个缺点：也种属间印迹(zooblotting)：用一个物种的DNA片段与相关物种的DNA进行Southern杂交，如果能得到一个或多个杂交信号的话，就表明该探针中可能hernDNA给出基因在DNA序列上的定位信息。获得定位信息最容易的方法是对相关cDNAcDNAcDNA和终点及外显子-内C??快速扩展cDNA末端(RapidamplificationofcDNAend,RACE)??异源双链分析(Heteroduplexanalysis)D.准确定位外显子-内含子边界的方法??异源双链分析(Heteroduplexanalysis)??外显子捕获(exontrapping)：需要一种特殊类型的包含一个小基因的载还要有起始转录所需要的序列信息(启动子序列)。2.确定单个基因的功能。2.1基因功能的计算机分析A.同源性反映出进化关系orthologousgene存在的同源基因，(2)旁系同源基因(paralogousgene)：指存在于相同生物体中的同源物，常是可识别的多基因家族的成员，它们的共同祖先可能早于或晚于物种间的分裂。B源分析可以提供整个基因或基因片段的功能信息DNA换为氨基酸序近的氨基酸分数就高(如亮氨酸-异亮氨酸，天冬氨酸-天冬酰胺)，不相关的氨基酸分数就低(半胱氨酸-酪氨酸，苯丙氨酸-丝氨酸)。tives??如果数据库中描述的基因的功能不正确，就会传递到新序列上。??同源基因可能具有不同的生物学功能。例如一些眼晶状体的晶体蛋白和代谢2.2用实验分析阐明基因功能A.通过基因失活进行功能分析A??因此，必须使用一类特殊类型的小鼠细胞：胚胎干细胞(ES细胞)，它是全能S鼠子宫中，小鼠胚胎会发育形成一个嵌合体。嵌合体小鼠的细胞由来自ES细胞b.利用插入突变进行基因失活起植株在表型上的变化，产生插入突变体，并以此向转座，如酵母转座子Ty1。TDNA插入，多为单拷贝。单拷贝T-DNA一旦整合??由于插入的T-DNA序列是已知的，因此可以利用质粒挽救法、反向PCR、I.质粒挽救法：是在载体上T-DNA左、右边界内加入大肠杆菌复制起始点和相应的选择标记基因，通过限制性内切酶进行酶切，将酶切片段自连成环状DNA脂糖凝胶分离，然后用T-DNA片段为探针进行杂交，将有杂交信号的酶切片段PCR制性内切酶。III.热不对称交错PCR法(TAIL-PCR)：通过3个嵌套的特异性引物(SP1,SP2,SP3，约20bp)分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(AD，约14bp)组的已知序列和插入T-DNA序列来设计引3’-端缺乏接头引物的结合位点，因此接头引物结合位点只能通过T-DNA特异c默方法NARNA。为一条自由的ssRNA(singlestrandedRNA)和一条绑在RISC上的ssRNA。基于碱基互补配对原则，被绑在RISC上的那条ssRNA可以从细胞质中存在的自??(2)病毒诱导的基因沉默系统(virus-inducedgenesilencing,VIGS)：X??dsRNA在Dicer酶作用下产生21~25个核苷酸的短干扰RNA(siRNA)。速通过VIGS技术分析功??VIGS技术还克服了基因家族功能冗余的问题，通过利用来自基因家族高度保然VIGS的优势显而易见，但其作为功能验证一个重要手段的同时，也存在??VIGS还可能不小心抑制非目标基因功能，这个可能性对于一个未进行基因测2.2用实验分析阐明基因功能B.基因过表达也可以用来探索功能C.基因失活或过表达对表型的影响可能很难辨别??基因失活或过表达实验的关键之处是需要鉴别表型改变。??对于任何生物体，必须检查的表型范围是很广的，很难全面评价。2.3未知基因编码蛋白质活性的详细研究达是基因组研究人员探索新基因功能的基本技术，但并不是能A.定点诱变可以用来详细探索基因的功能B.报告基因和免疫细胞化学可以用来定位基因的时空表达常用的报告基因：β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白免疫细胞化学(Immunocytochemistry)描述计算机方法(生物信息学方法)和实验方法分析基因组序列的优缺点；oticNuclearA?不同的真核生物具有不同的染色体数目，但染色体数目似乎与生物体的生物学特征没有关系(如酵母的染色体数目是果蝇的4倍)，与基因组大小也没有直接关系(如蝾螈基因组大小是人类的30倍，但染色体数目只有人类的一半)。DNA沿着DNA排列的?核酸酶保护实验揭示的规则性间隔表现为线性DNA上的核小体。连接DNA分隔，这样重复单位长190-220bp。每个连接组蛋白附着于一个核小“串珠样”结构?更常见的存在形式是一种更为紧密的称为30nm纤维的复合物。?30nm纤维内的每个核小体是通过连接组蛋白之间的相互作用而连接在一起。?全着丝粒染色体：着丝粒并不唯一，沿着染色体存在多个着丝粒结构。秀丽区域。随着对拟南芥着丝粒序列测定之后，人们发现拟南芥着丝粒DNA中含有少量基因(7-9genes/100kb)。?端粒是染色体末端的重要标志。AGGG2.1真核生物基因组中基因位于何处?基因在整个染色体上并不是均匀发布的。在一条染色体的不同位置，基因密?在拟南芥中，平均基因密度为25genes/100kb，但即使在着丝粒和端粒以外的区域，基因密度也可在每100kb有1-38个基因间变化。2.2在核基因组中基因是如何组织的A.基因只构成了人类基因组中的一部分?(2)包含88个全基因组范围内的重复序列。全基因组范围内的重复序列(散主要有4种类型：长散布核元件(LINE)，短散布核元件(SINE)，长末端重复元?(3)包含7个微卫星，其中有4个位于内含子中。长度的9.5%。中，外显子加起来只有48Mb，仅占总长度的1.5%。相比基因组的44%。C.酵母基因组是相当紧凑的?不同真核生物之间，基因组大小有很明显的差别：最小者不到10Mb，而最大者超过10万Mb。如脊椎动物和有花植物的基因?为此，我们将刚才分析的人类基因组的一个50kb片段和酵母的一个50kb片?(2)酵母中不连续的基因数目相对较少(0)。在整个酵母基因组中只有239。在酵母全基因组范围内重复C.其他真核生物中的基因编排个假设：越是复杂的真核生物，它们的基因组越不紧凑。，我们将人、酵母、果蝇和玉米的基因组进行了比较。2.3基因组中有多少基因，它们的功能又是什么?人的基因组中包含3-4万个基因，而在2000年草图完成的前几个月，最公认的推测是8-10万个基因，这是根据人细胞中的蛋白质的数目预测的。?我们现在知道，由于可变剪切的存在，基因的数目并不代表蛋白质的数目。?在人的3-4万个基因中，约半数基因的功能是已知的，其中绝大多数是蛋白RNA。这些功能已知的基因架和肌肉中结构蛋白的合成等。B.基因目录揭示了不同生物体的各自特征?真核生物基因组中，基因分类的方法：C.基因家族相同或相似序列的基因家族是许多基因组的共同特征。?有些多基因家族的成员虽然序列相似，但基因产物的特征却明显不同，如哺D其他进化遗迹?假基因：指具有与功能基因相似的序列，但不能翻译成有功能蛋白质的无功因是一种进化遗迹，表明基因组处于持续性变化的过程中。A因外，基因组还包括截短基因和基因片段等进化遗迹。因：与完整基因相比，或多或少缺失了部分序列的基因。片段：指从某个基因内部分割出来的短的区域。2.4真核生物基因组中的重复DNA序列?测序结果发现，人类基因组中约62%的部分为基因间隔区(intergenicregion)，即基因与基因之间的区域，不存在已知功能的基因组成分，以前将这部分DNA称为垃圾DNA(junkDNA)。?最近的研究结果发现这部分DNA可能存在潜在的功能，人们渐渐舍弃了junk?在大多数生物中，这些基因间隔区由重复DNA组成。?重复DNA可分为两大类：串联重复序列和散布重复序列(全基因组范围内重复序列)。A.串联重复DNA可见于真核生物染色体着丝粒及其他位置kb?虽然一部分卫星DNA散布于整个基因组，但大多位于着丝粒，它们可能作为B.小卫星和微卫星也是串联重复DNA。DNA与染色体结构特征有关，染色体端粒就是一种小卫星DNA。即当DNA复制时，微卫星拷贝有时发生滑移，导致插入或缺失(不常见)一个或C.散布重复序列布重复序列最常见的发生机制是转