第六章微生物的生长繁殖及其控制

第六章微生物的生长繁殖及其控制第1页，共84页，2023年，2月20日，星期二主要内容：6.1细菌的个体生长6.2微生物生长的测定6.3细菌的群体生长繁殖6.4环境对微生物生长影响6.5微生物生长繁殖的控制第2页，共84页，2023年，2月20日，星期二6.1细菌个体生长一、物质的复制－DNA1.在细菌个体生长过程中，DNA以双向的方式进行复制.2.生长迅速的细菌中，新产生的子细胞中已经有复制着的染色体DNA，即DNA复制与细胞分裂并非同步。第3页，共84页，2023年，2月20日，星期二1.球形菌的细胞壁扩增方式：在赤道板附近插入；2.杆形菌的细胞壁扩增方式：新老细胞壁间隔分布；3.细胞壁扩增的分子基础：短肽中第三位双氨基氨基酸的作用。G＋菌：L－赖氨酸；G－菌：二氨基庚二酸4.作用于细胞壁的酶：

二、细胞壁的扩增作用于双糖单位的：N－乙酰葡萄糖胺酶和N－乙酰胞壁酸酰胺酶肽聚糖短肽链的：转肽酶、内肽酶和羧肽酶第4页，共84页，2023年，2月20日，星期二三、细菌生长与分裂调节各种物质复制后，质膜内陷伴随新肽聚糖插入，导致横隔壁向心生长，最后会合，一分为二。

对细菌生长与分裂起调节作用的主要是于转肽酶和D,D－羧肽酶活性比。转肽酶活性高些，利于CW扩增，导致细菌生长。羧肽酶高些，利于横隔壁形成，导致细胞分裂。第5页，共84页，2023年，2月20日，星期二6.2微生物生长的测定评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；微生物生长第6页，共84页，2023年，2月20日，星期二个体计数法通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量；

微生物生长的测定方法生物量测定：重量测定、生理指标测定个体计数直接计数法间接计数法第7页，共84页，2023年，2月20日，星期二1.个体计数法A.直接法利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。1mm225（16）中格16（25）小格，共400小格缺点：不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；第8页，共84页，2023年，2月20日，星期二25X16型血球计数板第9页，共84页，2023年，2月20日，星期二B.简接法原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。稀释平板计数法先将待测菌液作一系列10倍稀释，使平皿上长出的菌落数在30-300个之间→

单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖

→

肉眼可见的菌落

→对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数

第10页，共84页，2023年，2月20日，星期二稀释平板计数法第11页，共84页，2023年，2月20日，星期二涂布平板法使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！（一般0.2ml）同一稀释度三个以上重复,取平均值；

每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；

样品充分混匀；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；

要求：每ml活菌数＝同一稀释度平均数×稀释倍数×5注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌第12页，共84页，2023年，2月20日，星期二平板计数法第13页，共84页，2023年，2月20日，星期二C.比浊法

在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。注意：测量应在菌浓度与O.D.成正比的线性范围内，否则不准第14页，共84页，2023年，2月20日，星期二2.重量法通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法。以干重（105℃）、湿重直接衡量微生物群体的生物量；第15页，共84页，2023年，2月20日，星期二蛋白质含量测定法从一定量培养物中分离出细菌，洗涤，以除去培养基带入的含氮物质。再用凯氏定氮法法测定总含氮量。一般细菌的含氮量约为原生质干重的14%。故，蛋白质总量=含氮量%×6.25蛋白质含量占细菌总重的～65％，故细胞总量＝蛋白质总量×1.54DNA含量测定法：利用DNA与DABA-2HCl(即新配制的20%W/W，3，5-二氨基苯甲酸-盐酸溶液)能显示特殊荧光反应的原理而设计的。因为每个细菌平均含DNA8.4×10-5纳克，可根据DNA含量计算出细菌的数量。第16页，共84页，2023年，2月20日，星期二3.生理指标测定法样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。常用于对微生物的快速鉴定与检测微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。第17页，共84页，2023年，2月20日，星期二6.3细菌群体的生长繁殖研究细菌群体培养的原因：由于个体微小；微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物的群体繁殖生长。第18页，共84页，2023年，2月20日，星期二曲线特征：根据微生物每小时的分裂代数（R）不同，一般可把生长曲线分成迟缓期（延滞期）、对数生长期、稳定期、衰亡期。一、细菌群体的生长规律生长曲线：细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。第19页，共84页，2023年，2月20日，星期二第20页，共84页，2023年，2月20日，星期二1.迟缓期（lagphase）生长速率常数等于零。细胞形态变大或增长（巨大芽孢杆菌接种3.4μm，培养5.5小时，19.8μm）胞内RNA尤其是rRNA含量增高;合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快）。对外界不良条件（氯化钠浓度、温度）抗生素等反应敏感。定义：少量微生物接种到新鲜培养基，开始的一段时间内数目不增加的时期。特点：第21页，共84页，2023年，2月20日，星期二采取缩短延迟期的措施：在生产实践中，通常采取的措施有增加接种量；在种子培养中加入发酵培养基的某些营养成分采用最适种龄(即处于对数期的菌种)的健壮菌种接种以及选用繁殖快的菌种等措施，以缩短延迟期，加速发酵周期，提高设备利用率。延迟期出现的原因：可能是为了调整代谢。当细胞接种到新的环境(如从固体培养接种至液体培养基)后，需要重新合成必需量的酶、辅酶或某些中间代谢产物，以适应新的环境。影响延迟期的因素：菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等。第22页，共84页，2023年，2月20日，星期二定义：延滞期之后细胞以几何级数速度分裂的一段时期。特点：生长速率常数最大。细胞代时（分裂一次）或倍增时间（原生质增加一倍）最短。细胞平衡生长，菌体内各种成分最均匀。酶活性活跃，代谢旺盛。2.对数期（logarithmicphase）第23页，共84页，2023年，2月20日，星期二影响指数期微生物增代时间的因素:①菌种：不同菌种的代时差别极大

③营养物浓度：营养物的浓度可影响微生物的生长速率和总生长量。

E.coli

肉汤中37℃代时17分钟。

Nitrobacter.agilis

组合培养基中27℃代时1200分钟（活化硝化杆菌）

E.coli

牛奶37℃

12.5分钟。肉汤中37℃

17分钟。②营养成分：同一种细菌，在营养物丰富的培养基中生长，其代时较短，反之则长。第24页，共84页，2023年，2月20日，星期二④培养温度：

温度对微生物的生长速率有极其明显的影响

第25页，共84页，2023年，2月20日，星期二应用:指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致、细胞成分平衡发展和生长速率恒定，故①作为代谢、生理等研究的良好材料;②是增殖噬菌体的最适宿主菌龄;③也是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄。

第26页，共84页，2023年，2月20日，星期二

定义：对数期后，生长速率降为零的生长期。

特点：

（1）生长速率为零，新产生细胞数＝死亡细胞数。（2）菌体产量（活菌数最大）（3）细胞开始贮存糖原、异染粒、脂肪；多数芽孢杆菌开始产生芽孢；有的微生物开始合成次生代谢产物。3.稳定期（stationaryphase）第27页，共84页，2023年，2月20日，星期二原因：（1）营养物耗尽。（2）营养的比例失调。（3）有害代谢产物积累（酸、醇、H2O2

）（4）pH值、氧化还原电势不适宜。稳定期于生产上的意义：生产菌体和与菌体平行生长的代谢产物（单细胞蛋白,乳酸）的最佳收获期。第28页，共84页，2023年，2月20日，星期二定义：由于营养物耗尽，代谢产物积累，细菌死亡速度大于新生速度的时期。特点：细菌代谢活性降低；细菌衰老并出现自溶；产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应4.衰亡期（declinephase）第29页，共84页，2023年，2月20日，星期二1.同步培养与同步生长同步培养：是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。同步生长：通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态。三、细菌的同步培养第30页，共84页，2023年，2月20日，星期二同步培养的方法：机械法：在不同生长阶段的细胞体积与质量或同某种材料结合能力不同①离心法（密度梯度离心）：处于同一生长期的细胞体积与质量相当。②过滤法：使用孔径大小不同的滤器（微孔滤器）③硝酸纤维素滤膜法（Helmstetter-cummings技术）同一生长期细菌与膜结合牢固程度相当。第31页，共84页，2023年，2月20日，星期二获得同步生长的方法：诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。第32页，共84页，2023年，2月20日，星期二原理：细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。第33页，共84页，2023年，2月20日，星期二连续培养：指在微生物的整个培养期间，通过一定处理使其能以恒定比生长速率生长并持续生长下去的培养方法。通过认识稳定期到来的原因，采取相应措施实现微生物长期保持在指数生长平衡状态和稳定的生长速率。即对数生长后期，以一定速率补充新鲜培养液，再以同样速率移去培养物。四、连续培养第34页，共84页，2023年，2月20日，星期二第35页，共84页，2023年，2月20日，星期二连续培养两种类型：恒化器连续培养、恒浊器连续培养恒化：某种营养物质维持恒定恒浊：菌恒定第36页，共84页，2023年，2月20日，星期二恒浊器连续培养测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；第37页，共84页，2023年，2月20日，星期二连续发酵优点：一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业

缩短发酵周期，提高设备利用率；

便于自动控制；

降低动力消耗及体力劳动强度；

产品质量较稳定；杂菌污染和菌种退化缺点：恒浊器连续培养第38页，共84页，2023年，2月20日，星期二恒化器连续培养

使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质，如aa和氨等氮源，或G、麦芽糖等碳源或者是无机盐，一定浓度范围内决定细菌生长速率。恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低浓度，作为限制性因子，而其他营养物均过量。第39页，共84页，2023年，2月20日，星期二两种连续培养器的比较第40页，共84页，2023年，2月20日，星期二五、微生物的高密度培养微生物的高密度培养指在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术.现在报道的最高记录是:E.coliW3110的174g(湿重)/L;高密度培养常用于重组蛋白质药物的生产;主要的优势:节约成本.选取最佳培养基成分和各成分含量补料提高溶解氧的浓度防止有害代谢产物的生成第41页，共84页，2023年，2月20日，星期二六、微生物培养法概论实验室培养法;生产实践中微生物培养法;第42页，共84页，2023年，2月20日，星期二实验室培养法固体培养法好氧菌：斜面、琼脂平板等厌氧菌：高层琼脂柱、厌氧培养皿、厌氧罐等液体培养法试管液体培养三角瓶液体培养摇瓶培养台式发酵罐第43页，共84页，2023年，2月20日，星期二生产实践中微生物培养法固体培养法好氧菌：曲法培养（料薄、通气）厌氧菌：堆积培养液体培养法浅盘培养发酵罐：最大的1500吨第44页，共84页，2023年，2月20日，星期二第45页，共84页，2023年，2月20日，星期二6.4影响微生物生长的重要因素生命的存在依赖于外界环境提供营养、水分、合适的环境因素（如：pH、氧化还原电位、温度、氧气）同时又受到外界环境因子的制约，二者是一致的。一、营养针对营养缺乏，微生物往往采取：

1、减少甚至停止合成细胞物质。

2、加速代谢（非必要成分或失效成分的降解）。二、水适宜的aw值。

aw值不同造成渗透压不同影响微生物生长速率第46页，共84页，2023年，2月20日，星期二三、温度根据最适温度的不同，可将微生物分为嗜冷、兼性嗜冷、嗜温、嗜热、超嗜热；各种微生物都有其生长繁殖的最低温度、最适温度、最高温度和致死温度。温度对微生物的影响具体表现在：影响酶的活性影响细胞质膜的流动性影响物质的溶解度第47页，共84页，2023年，2月20日，星期二最低生长温度是指微生物能进行繁殖的最低温度界限。最适生长温度是指某微生物群体生长繁殖速度最快的温度，代时也最短。最高生长温度是指微生物生长繁殖的最高温度界限。在此温度下，微生物细胞易于衰老和死亡。致死温度最高生长温度若进一步升高，便可杀微生物。第48页，共84页，2023年，2月20日，星期二上述“最适温度”仅是标定微生物繁殖最快的温度，实际上不同的生理生化过程有不同的最适温度（如下表）类型生长温度℃发酵温度℃累积产物温度℃灰色链霉菌3728－丙酮丁醇梭菌3733－产黄青霉302520国外曾报道，对P.chrysogenus进行阶段性温度控制：开始5小时40小时125小时165小时青霉素产量较始终25℃恒温培养高14.7。30℃25℃25℃20℃第49页，共84页，2023年，2月20日，星期二1.从微生物群体来看，pH范围很广，但绝大部分所需5－9的pH值。微生物对pH值的忍受范围也有最低、最适、最高三个数值点。用最适pH值与水比较，可把微生物区分为：嗜酸性嗜中性嗜碱性pH＜5.45.4－8.57.0－11.5例:真菌、古生菌（大部分）大多盐杆菌属、嗜盐菌（古生菌）四、pH值第50页，共84页，2023年，2月20日，星期二第51页，共84页，2023年，2月20日，星期二2.与对温度的需求随生理生化过程的不同而异相仿，微生物的生理生化过程不同也要求不同的pH值。最适pH值合成抗生素pH值S.griseus（灰链）6.3－6.96.7－7.3P.chrysogenum（产黄青霉）6.5－7.26.2－6.8红霉素链霉菌6.6－7.06.8－7.3第52页，共84页，2023年，2月20日，星期二极端pH环境下的微生物其内环境pH稳定，保持在7左右。细胞通过本身结构或生理过程来达到这一目的。例子：嗜酸性微生物其CM可阻止过多H+进入胞内，并不断将H+排出体外，还有的M有不易渗透的细胞壁，可防止CM暴露于极端pH中受损，不仅如此，微生物生命活动还可以改变外界pH值，一般情况下，随着培养时间延长，培养基或多或少都会变酸。pH对微生物影响的分子机理：（1）酶促反应（即酶的活性所需的pH值）。（2）膜透性与结构稳定性。（3）物质溶解性。第53页，共84页，2023年，2月20日，星期二五、氧气好氧微生物专性好氧微生物：氧气为呼吸链[H]受体、胞内有SOD、H2O2酶[大多数真菌、多数细菌、放线菌]微好氧微生物：氧气为呼吸链[H]受体，但分压低。兼性厌氧微生物：氧或其它物作[H]受体，胞内SOD、H2O2酶[酵母菌（酿酒酵母）、部分细菌（肠杆菌）］1.根据对氧的需求与否，微生物可分好氧、厌氧微生物第54页，共84页，2023年，2月20日，星期二耐氧微生物：可在有氧气环境下进行厌氧生活的菌。无呼吸链，只能发酵，胞内有SOD、过氧化物酶。（乳酸菌）厌氧微生物：可通过发酵、无氧呼吸、甲烷发酵、环式光合磷酸化产能。胞内无SOD酶、H2O2酶。（梭菌属、梭杆菌属、产甲烷细菌）厌氧微生物第55页，共84页，2023年，2月20日，星期二五类对氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态模式图第56页，共84页，2023年，2月20日，星期二几个相关概念：抑制：亚致死剂量因子作用使生长停止；死亡：生长能力不可逆丧失；防腐：理化因素防止或抑制微生物生长；消毒：杀死或灭活所有病原微生物；灭菌：杀死包括芽孢在内的所有菌；化疗：选择毒性化学物质对生物体内部感染组织

或细胞进行治疗，对机体本身无毒害作用。6.5微生物生长繁殖的控制控制（有害）微生物生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要意义。第57页，共84页，2023年，2月20日，星期二1.抗微生物剂2.抗代谢剂3.抗生素一、控制微生物的化学物质第58页，共84页，2023年，2月20日，星期二1．抗微生物剂抗微生物剂(antimicrobialagcnt)是一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质根据它们抗微生物的特性可分为：

抑菌剂

杀菌剂

溶菌剂

作用机理是这类物质结合到核糖体上抑制蛋白质合成，导致生长停止，由于它们同核糖体结合不紧，它们在浓度降低时又会游离出来，核糖体合成蛋白质的能力恢复，使生长恢复它们是紧紧地结合到细胞的作用靶上，即使在浓度降低时也不能游离出来，因此生长不能恢复能抑制细胞壁合成或损伤细胞质膜第59页，共84页，2023年，2月20日，星期二根据作用效果和作用范围抗微生物剂通常又将它们分为：消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。HgCl2、CuSO4、碘液、氯气、乙烯氧化物、甲醛剂、臭氧有机汞、0.1%-1％硝酸银、碘液、70%乙醇、3％过氧化氢第60页，共84页，2023年，2月20日，星期二各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：石炭酸系数(phenolcoefficient

)：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。在临床上最早使用的消毒剂----石炭酸第61页，共84页，2023年，2月20日，星期二生长因子的结构类似物干扰达到抑制微生物生长目的。如：

叶酸对抗物（磺胺）、

嘌呤对抗物（6-巯基嘌呤）、

苯丙氨酸对抗物（对氟苯丙氨酸）、

尿嘧啶对抗物（5-氟尿嘧啶）

胸腺嘧啶对抗物（5-溴胸腺嘧啶）

等等2.抗代谢物第62页，共84页，2023年，2月20日，星期二某些生物合成或半合成的次级代谢产物或衍生物，抑制或杀死其他微生物。主要通过：抑制CW合成、破坏CM、作用呼吸链、抑制Pr核酸合成。

3.抗生素（antibiotic）第63页，共84页，2023年，2月20日，星期二第64页，共84页，2023年，2月20日，星期二第65页，共84页，2023年，2月20日，星期二第66页，共84页，2023年，2月20日，星期二第67页，共84页，2023年，2月20日，星期二半合成抗生素半合成抗生素：对天然抗生素的结构进行改造后的抗生素青霉素与6－APA。前者优点明显。如：抗菌活力高，毒性低，但更存在致命的缺点，易过敏，不稳定，不能口服，不耐酸，易于产生抗药菌株。关于改进青霉素，研究其化学结构中有一高度保守的共同结构－6－氨基青霉烷酸（6－APA），虽纯6－APA抑菌效果较弱，但是半合成青霉素的母核因此工业中取6－APA与不同化学侧链催化，以合成各种不同的半合成青霉素，如：氨苄青毒素、羧苄青毒素、羟氨苄青毒素。第68页，共84页，2023年，2月20日，星期二细胞质膜透性改变：使抗生素不进入细胞；药物作用靶改变：合成了修饰抗生素的酶：抗性菌株发生遗传变异导致抗药性菌株的可能原因：第69页，共84页，2023年，2月20日，星期二第一次剂量充足；避免长时间重复使用一种抗生素；不同抗生素混合使用；对现有抗生素改造；筛选更新抗生素；等所以，抗生素使用要注意：第70页，共84页，2023年，2月20日，星期二1.高温高压蒸汽灭菌煮沸消毒间歇灭菌干热灭菌热敏感物质采用超高温135～150℃，2～6s，如：牛奶、液体食品等。巴斯德消毒法：60-85℃处理15秒至30秒二、控制微生物物理因素第71页，共84页，2023年，2月20日，星期二十倍致死时间（decimalreduction,D）：一定温度条件微生物数量十倍减少所需要的时间。D值大小还随微生物的种类、生长时期、检测培养基的性质等因素有关。多数细菌和真菌的营养细胞：在60