第二章基因操作的工具酶

第二章基因操作的工具酶第1页，共65页，2023年，2月20日，星期一《基因工程原理》第一章导论第二章基因操作的工具酶第三章基因克隆的载体第四章基因克隆的策略第五章克隆基因的表达第六章基因工程的基本技术第2页，共65页，2023年，2月20日，星期一第二章基因操作的工具酶第一节限制性核酸内切酶及其应用第二节DNA连接酶及其应用第三节DNA聚合酶及其应用第四节修饰性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.

第3页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节限制性核酸内切酶及其应用第4页，共65页，2023年，2月20日，星期一50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象(B)(K)大肠杆菌B大肠杆菌K114×10—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating第5页，共65页，2023年，2月20日，星期一限制—修饰的酶学假说(B)(B)酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰Methylation基因组DNA不被切割1968年，Meselson和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶；1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶HindII，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。第6页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节限制性核酸内切酶第7页，共65页，2023年，2月20日，星期一限制性核酸内切酶的概念

限制性核酸内切酶（Restrictionendonucleases）：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300中微生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。第8页，共65页，2023年，2月20日，星期一限制性核酸内切酶的分类1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中I型单一多功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点1000bp不是无用II型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+特异性位点及其附近是非常有用III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3‘端24-26bp处是有用第9页，共65页，2023年，2月20日，星期一限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichiacoli

表示为Eco,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae

表示为

Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如EcoRI、HindIII。第10页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节限制性核酸内切酶第11页，共65页，2023年，2月20日，星期一II型限制性核酸内切酶的3大特点1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4、5、6或7个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性

靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性

双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。第12页，共65页，2023年，2月20日，星期一§2.3核酸的分子结构回文序列所谓回文序列就是指DNA某一片段旋转180。后,顺序不变的序列，回文序列中的单链可形成发夹结构。双链可形成十字架结构。这种发夹结构或十字架结构在大肠杆菌细胞DNA中已有发现.第13页，共65页，2023年，2月20日，星期一§2.3核酸的分子结构核酸分子中的回文序列第14页，共65页，2023年，2月20日，星期一§2.3核酸的分子结构

回文序列中的单链可形成发卡结构第15页，共65页，2023年，2月20日，星期一§2.3核酸的分子结构双链回文序列可形成十字架结构第16页，共65页，2023年，2月20日，星期一与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端

cohesive

ends因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很

容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。平末端

Bluntend因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。同裂酶

isoschizomers能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。同尾酶

isocaudamers识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。注意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。第17页，共65页，2023年，2月20日，星期一几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

第18页，共65页，2023年，2月20日，星期一EcoRI的识别位点GAATTC5’3’CTTAAG3’5’AATTCG5’-粘性末端HindIII的识别位点TTCGAAAAGCTT5’3’3’5’AGCTTA5’-粘性末端限制性内切酶第19页，共65页，2023年，2月20日，星期一HaeIII的识别位点PstI的识别位点GGCC5’3’CCGG3’5’CTGCAG5’3’GACGTC3’5’GGCCCCGG平整末端CTGCAG3’-粘性末端限制性内切酶第20页，共65页，2023年，2月20日，星期一

经同尾酶消化的DNA末端连接示意图5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’BamHI5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’BglII5’XXXXA

GATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAG

AXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’BamHIBglII第21页，共65页，2023年，2月20日，星期一

推测酶切割位点出现的频率对于推断DNA酶切片段大小很有用。假定4种核苷酸在DNA分子上出现的频率相同，那么靶序列为6个核苷酸的内切酶在每46（=4096）个核苷酸中酶切位点就有一次出现机会。据此推算，一条4900bp长的DNA中有12个6核苷酸识别序列的酶切位点（49000/4096）。但事实上并非真正如此，因为DNA分子中4种碱基的出现频率并不均等。识别位点在DNA分子上出现的频率第22页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节限制性核酸内切酶第23页，共65页，2023年，2月20日，星期一

一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，50L反应体系中完全降解1gDNA所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：A。DNA的纯度和甲基化程度B。甘油的含量（不超过5%）C。反应体系中的离子强度D。反应体系的pH值F。反应的温度条件（通常为37℃

）酶单位的定义和影响酶活性的因素Buffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L

第24页，共65页，2023年，2月20日，星期一酶切反应的基本步骤＋－电泳紫外分析37℃1h加反应液CKMBuffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L

1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT第25页，共65页，2023年，2月20日，星期一第二章基因操作的工具酶第一节限制性核酸内切酶及其应用第二节DNA连接酶及其应用第三节DNA聚合酶及其应用第四节修饰性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.第26页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、DNA连接酶作用的特点2、DNA连接酶的反应条件3、DNA连接的策略第二节DNA连接酶及其应用第27页，共65页，2023年，2月20日，星期一DNA连接酶的发现

环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种Nick的酶存在。

1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条

DNA链之间形成磷酸二酯键的酶——DNA连接酶（ligase）。DNA连接酶由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子；T4DNA连接酶

由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。（1970年）容易制备，而且可以连接完全配对的平末端DNA分子，所以在基因克隆中应用广泛。NickNick第28页，共65页，2023年，2月20日，星期一DNA连接酶作用的特点A.连接的两条链必须分别具有3′端自由羟基（-OH）和5′端磷酸基团（-P），而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应；B.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。OKNO第29页，共65页，2023年，2月20日，星期一载体去磷防止自连的应用示例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH连接酶连接酶连接酶碱性磷酸酶2Pi寄主修复缺口载体自连或产生二具体等第30页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、DNA连接酶作用的机理2、DNA连接酶的反应条件3、DNA连接的策略第二节DNA连接酶及其应用第31页，共65页，2023年，2月20日，星期一DNA连接反应的条件

连接反应最佳温度为37℃，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI粘性末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开。所以通常在4-15℃连接。影响连接效率的因素有：A.温度（最主要的因素）B.ATP的浓度(10M-1M)C.连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）D.反应时间（通常连接过夜）E.插入片段和载体片段的摩尔比转化4℃过夜加反应液CK-重组菌落CK+第32页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、DNA连接酶作用的机理2、DNA连接酶的反应条件3、DNA连接的策略第二节DNA连接酶及其应用第33页，共65页，2023年，2月20日，星期一粘性末端DNA片段的连接NickNick第34页，共65页，2023年，2月20日，星期一平末端DNA片段的末端加尾连接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶第35页，共65页，2023年，2月20日，星期一平末端DNA片段加接头连接法

衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNA片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4连接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA第36页，共65页，2023年，2月20日，星期一第二章基因操作的工具酶第一节限制性核酸内切酶及其应用第二节DNA连接酶及其应用第三节DNA聚合酶及其应用第四节修饰性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.第37页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）第三节DNA聚合酶及其应用第38页，共65页，2023年，2月20日，星期一

大肠杆菌DNA聚合酶I

（E。ColiDNApolI）是KornbergA.1956年首先从大肠杆菌E。Coli细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括3种不同的酶活力：5′-3′聚合酶活性以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的3′末端，并不断延伸。5′-3′外切酶活性将双链DNA中游离的5′末端逐个切去。3′-5′外切酶活性将游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T第39页，共65页，2023年，2月20日，星期一

大肠杆菌DNA聚合酶I的三种用途A.制备高比活度的DNA探针

利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于DNA连接后的大缺口填充

利用5′--3′的聚合酶活性。C.用于DNA的序列分析

利用5′--3′的聚合酶活性。第40页，共65页，2023年，2月20日，星期一

大肠杆菌聚合酶I的应用示例CCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+缺口转移(Nicktranslation)CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCT第41页，共65页，2023年，2月20日，星期一缺口转移(Nicktranslation)第42页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）第三节DNA聚合酶及其应用第43页，共65页，2023年，2月20日，星期一

Klenow片段的主要用途Klenow片段大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。Klenow片段的主要用途修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端标记DNA片段的末端cDNA克隆中第二链cDNA的合成DNA序列的测定GAACTTAA第44页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）第三节DNA聚合酶及其应用第45页，共65页，2023年，2月20日，星期一

T4DNA聚合酶的特点T4DNA聚合酶是

从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它和Klenow片段一样具有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶I的活性高200倍。特别是，T4DNA聚合酶还有第三种活力—取代反应：如果反应体系中仅存在一种dNTP，这时T4DNA聚合酶就会表现出3′→5′外切酶活力，从双链DNA的3′开始降解，直到露出和缺乏的那中dNTP互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反应。CGTCGCGCAGCGCGTGCAGCGdTTPMg++CGGCAGCGdTTPMg++第46页，共65页，2023年，2月20日，星期一

T4DNA聚合酶的用途1、以填充反应标记有5′端延伸的双链

DNA片段2、以取代反应标记延伸末端或平头末端的双链DNA片段3、用于DNA序列分析第47页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）第三节DNA聚合酶及其应用第48页，共65页，2023年，2月20日，星期一

逆转录酶—Reversetranscriptase逆转录酶是

一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA(complementaryDNA).实际上，它也是一种RNA依赖的DNA聚合酶。逆转录酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的《Nature》杂志上。主要用途是

将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

第49页，共65页，2023年，2月20日，星期一第二章基因操作的工具酶第一节限制性核酸内切酶及其应用第二节DNA连接酶及其应用第三节DNA聚合酶及其应用第四节修饰性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.第50页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、末端转移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）4、碱性磷酸化酶第四节修饰性工具酶第51页，共65页，2023年，2月20日，星期一末端转移酶的特性末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到DNA的在3‘羟基，特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有效。最常见的用途是在酶切产生的平末端加尾以便于创造粘性的互补末端。第52页，共65页，2023年，2月20日，星期一

Charactersofthepolymerase

Terminaltransferaseisthecommonnameoftemplate-independantDNApolymerase.Thisenzymeisisolatedfromcalfthymusandcanaddnucleotidesto3'hydroxylgroupsofDNAwithouttheneedforatemplate.The

bestprimeris

doublestrandedDNA(dsDNA)withbluntends.Purinebasesrequiremagnesiumionsandpyrimidinebasesrequirecobaltions.Theenzymebuildsup

homopolymerchains

ifsuppliedwithappropriatedNTPs.ThemostcommonuseforthisenzymeisthegenerationofcomplementarytailsonDNAfragmentsandvectorscutwithrestrictionenzymeswhichgeneratebluntends.第53页，共65页，2023年，2月20日，星期一平末端DNA片段的末端加尾连接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶第54页，共65页，2023年，2月20日，星期一1、末端转移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）3、碱性磷酸化酶（Alkalinephosphatase）第四节修饰性工具酶第55页，共65页，2023年，2月20日，星期一

核酸酶SI的特性

这是一种从米曲霉（Aspergillusoryzae）中分离的可以降解单链DNA或RNA的外切酶。其主要用途有：A、在cDNA合成过程中，切开cDNA的