目的基因的克隆

目的基因的克隆第1页，共28页，2023年，2月20日，星期一基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。第2页，共28页，2023年，2月20日，星期一一鸟枪法1.鸟枪法克隆目的基因的基本战略2.鸟枪法操作的改进3.鸟枪法克隆目的基因的局限性基因测序“鸟枪法”，也俗称“霰弹法”。简单地说，它有点类似生活中玩的拼图游戏。拼图游戏是将一个完整的画面分成杂乱无章的碎块，然后重新拼装复原。而“鸟枪法”则是先将整个基因组打乱，切成随机碎片，然后测定每个小片段序列，最终利用计算机对这些切片进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。“鸟枪法”最初主要用于测定微生物基因组序列。近年来，美国塞莱拉公司先后利用改进的全基因组“鸟枪法”完成了果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它在测定大基因组上的可行性和有效性。“鸟枪法”优点是速度快，简单易行，成本较低。

第3页，共28页，2023年，2月20日，星期一1.鸟枪法克隆目的基因的基本战略

随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。第4页，共28页，2023年，2月20日，星期一（1）染色体DNA的切断

超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。

全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。（2）与载体连接

如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为（3）转化受体细胞

受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。（4）筛选含有目的基因的目的重组子

菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。

第5页，共28页，2023年，2月20日，星期一2.鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率。（1）使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA

第6页，共28页，2023年，2月20日，星期一例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0

kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接在连接前将DNA片段进行分级分离

2.0kb1.6kb1.8kb第7页，共28页，2023年，2月20日，星期一冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法凝胶DNA片段回收技术

第8页，共28页，2023年，2月20日，星期一结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA的目的。适合于从1～4mL细菌培养物中提取多至20μg高纯的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。第9页，共28页，2023年，2月20日，星期一3.鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构第10页，共28页，2023年，2月20日，星期一二、cDNA法1.cDNA法克隆目的基因的基本战略2.cDNA法分离目的基因的基本程序3.cDNA法法克隆目的基因的局限性第11页，共28页，2023年，2月20日，星期一mDNA（1）cDNA第一链的合成

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5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs1.cDNA法克隆目的基因的基本战略第12页，共28页，2023年，2月20日，星期一（2）cDNA第二链的合成

煮沸NaOH①自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

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3’KlenowdNTPsS1自身环化形成发夹结构降解双链中的单链，如发夹结构第13页，共28页，2023年，2月20日，星期一DNApoldNTPsRNaesH②置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失5‘ppp’5G

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3’3’T4-DNAligase焦磷酸钠存在条件下合成cDNA第一链第14页，共28页，2023年，2月20日，星期一dCTPTdT③引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

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3’NaOH退火KlenowdNTPs第15页，共28页，2023年，2月20日，星期一（3）双链cDNA的克隆

双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：

平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收。

平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组。分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段。加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收。

第16页，共28页，2023年，2月20日，星期一2.cDNA法分离目的基因的基本程序（1）完备分离程序

提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子。筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选。完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等。第17页，共28页，2023年，2月20日，星期一（2）特异分离程序

提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆。特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等。

第18页，共28页，2023年，2月20日，星期一（3）差异分离程序

利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因。例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。第19页，共28页，2023年，2月20日，星期一差异分离程序

多瘤病毒感染的FR3T3细胞正常的FR3T3细胞总mRNA总mRNAcDNA双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆提取mRNA共价交联上柱原位杂交病毒诱导表达的基因cDNA克隆第20页，共28页，2023年，2月20日，星期一3.cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构。

细菌或原核生物的mRNA半衰期很短。mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难。仅限于克隆蛋白质编码基因。

第21页，共28页，2023年，2月20日，星期一三PCR法

PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。1.PCR法定向扩增目的基因的基本原理第22页，共28页，2023年，2月20日，星期一由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆

2.PCR克隆目的基因的基本程序5’5’AATT5’5’PCR扩增产物T载体T7lacZMCSoriApr第23页，共28页，2023年，2月20日，星期一四化学合成法1.化学合成法的基本战略2.化学合成的单元操作3.DNA化学合成的用途第24页，共28页，2023年，2月20日，星期一1.化学合成法的基本战略（1）全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：①小片段粘接法

混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体

第25页，共28页，2023年，2月20日，星期一②补钉延长法混合退火根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体

Klenow酶聚合第26页，共28页，2023年，2月20日，星期一③大片段酶促法混合退火根据目的基因的全