利用SSR标记分析当前4水系中华绒螯蟹天然群体的遗传特征

利用SSR标记分析当前4水系中华绒螯蟹天然群体的遗传特征1摘要：利用6对微卫星引物对当前长江、辽河、瓯江以及莱茵河水系F2代4个中华绒螯蟹天然群体共计80个个体进行群体遗传学研究。结果表明：4个中华绒螯蟹群体均具有较高的遗传多样性（总体平均期望杂合度He为0.7411），各个群体的平均有效等位基因数在4.3333〜4.500之间。各位点上的观察杂合度（Ho）均高于期望杂合度（He），其中长江群体、辽河群体、瓯江群体和以及莱茵河F2代群体的平均观察杂合度分别为0.9167、0.9584、0.9306、0.7995，平均期望杂合度分别为0.7496、0.7416、0.7585、0.7149。其中瓯江群体的平均期望杂合度最高（平均He为0.7585）,莱茵河F2代群体最低（平均He为0.7149）,各群体间无显著性差异（P>0.05）。本研究中各中华绒螯蟹群体在6个微卫星位点上的固定指数Fis均为负值，其中辽河群体的Fis最小（-0.3485）,莱茵河F2代的Fis最大（-0.1669）,提示各中华绒螯蟹天然群体内部均存在着较为明显的远缘繁殖现象。本研究中各中华绒螯蟹天然群体间的遗传距离介于0.0688至0.1743之间，其中长江群体与辽河群体间的遗传距离最小（0.0688），瓯江群体与莱茵河水系F2代群体间的遗传距离最大（0.1743）。本研究中4个群体间的平均基因流Nm均大于1,其中长江群体与辽河群体、莱茵河水系F2间的Nm较大（分别为20.3629和14.3851）,遗传分化指数Fst较小（分别为0.0121和0.0171）。聚类分析结果显示，长江群体与辽河群体首先聚为一支后，然后与莱茵河F2群体相聚，而瓯江群体单独聚为一支。AMOVA分析结果表明，本研究中各群体间的基因交流比较频繁（总体Nm为5.943），群体间的遗传分化较小（总体Fst为0.0403），其中大部分遗传变异存在于中华绒螯蟹各群体内部（95.96%）,存在于群体间的遗传变异较少（4.04%）（PV0.05）,结果提示当前各水系中华绒螯蟹的种质混杂情况已较为严重。关键词：中华绒螯蟹；微卫星；种质混杂.中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）俗称河蟹，主要分布于中国长江、辽河、瓯江等水域,但群体自然分布以长江流域为主。与瓯江、辽河等水系所产河蟹相比，长江水系中华绒螯蟹在生长性能及肉质品质上具有明显优势，深受消费者青睐。自上世纪60年代发现长江口大眼幼体为中华绒螯蟹蟹苗以来至80年代初期，在我国北起内蒙、辽宁，南至珠江口，西至新疆博斯腾湖都进行了长江水系中华绒螯蟹的人工增殖放流活动，推动了我国中华绒螯蟹蟹增殖业的迅猛发展［1］。由于对长江口天然蟹苗的酷捕滥捞、江湖建闸以及水质污染等原因，从1982年起长江中华绒螯蟹天然蟹苗资源开始骤然衰退。在这种情况下，1984年起辽河水系、瓯江水系的蟹苗开始被大量开发利用，在一段时间内几乎占领了整个河蟹增养殖市场［2］。自20世纪70年代末突破中华绒螯蟹人工育苗技术难关以来，由于天然苗种产量越来越少，越来越多的苗种开始来源于人工养殖群体。20世纪90年代以来，河蟹人工培苗技术已十分成熟，许多育苗单位为了降低成本，普遍选用小规格中华绒螯蟹用于苗种繁育，甚至无序引进外水系亲蟹和蟹苗用于苗种生产。不同水系群体的频繁引种和培育苗种的盲目放流，以及人工养殖群体向自然水体的逃逸，打破了各水系中华绒螯蟹的天然分布格局，加剧了各水系天然水域中华绒螯蟹的种质混杂程度［3-4］。近年来，许多科研单位已针对中华绒螯蟹种质特征已开展了许多研究工作。总体而言，这些研究多侧重分析不同水系间中华绒螯蟹的生物学特性［5-6］，寻找区分不同水系群体的特异遗传标记［7-9］，研究各水系中华绒螯蟹的遗传多样性指数以及系统发育等方面［10-15］，目前尚未见对当前不同水系中华绒螯蟹天然群体间基因交流和种质混杂的研究报道。在当前各水系中华绒螯蟹种群交流非常频繁的情况下，本研究采用微卫星技术研究了当前各水系中华绒螯蟹天然群体的遗传差异，分析了不同群体间的遗传结构和基因交流情况，旨在为后续中华绒螯蟹种质资源保护与合理开发利用提供理论依据。1材料与方法1.1材料长江、辽河以及瓯江水系中华绒螯蟹天然苗种分别采自江苏长江南京段、辽宁省辽河辽阳段、浙江省瓯江温州段，莱茵河水系中华绒螯蟹F2代取自江苏高淳国家级中华绒螯蟹原良种场（图1）。采样时间为2009年3月28日至6月8日，每个群体采样量均大于200只，样品鉴定参照GB/T19783-2005进行，样品均活体运输至实验室后-20°C冷冻保存备用。图1中华绒螯蟹4群体采样地点Fig.1Samplingsitesofthe4Eriocheirsinensisstocks1.2微卫星引物选取HanflingBM］报道的6对微卫星引物序列用于各群体中华绒螯蟹的群体遗传学研究，引物由上海英骏生物公司合成，引物序列、PCR反应条件、扩增产物长度等信息见表1。表16个中华绒螯蟹微卫星位点的特征Tab.1Characterizationof6microsatelliteslociofE.sinensis微卫星位点引物退火温度PCR产物长度LocusPrimerAnnealingtemperatureLengthofPCRproductsES18F:CACCGTAAGGTTCCGTAAR:AAGCACCCATAAGTCAATGTA58C170-225ES06F:CCCTTCCATTATCTTAACCTGR:CTGTGCTTCGTCTGTGTATG58C105-180ES67F:TTTGGGATTCACCTTGTCAACTTR:CGACGCACGACAGAGGAGAGG53C105-170ES74F:ACAGCAAGTGGCAACAGGTAAACR:CCGCCCAGCCTCCCGTCAAC58C105-195ES36F:GAGCGAGTATGCAAATGAGTAATR:TTCATTCACGAACAAAACACTAA50C227-430ES87F:CGGAGTGTTTTGTTTGTCR:ATCATCAGCAGCAACCAC55C134-1891.3方法1.3・1DNA模板制备随机从长江群体、辽河群体、瓯江群体及莱茵河水系F2代群体中抽取20只用于微卫星分析，采用常规的酚-氯仿法提取基因组DNA,1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，紫外分光光度法检测样品DNA浓度及纯度，双蒸水稀释至50卩g/mL后备用。PCR扩增与SSR引物筛选PCR扩增在BiometraPCR仪上进行，PCR反应体系(TAKARA)为25卩L，其中包括：10xbuffer2.5pL，Mg2+(2.5mmol/L)5pL，dNTP(2.5mmol/L)2pL,正反向引物(10pmol/L)各1卩L,Taq酶0.5U,最后加ddH2O补足体积至25卩L。PCR反应共计30个循环，循环前96°C预变性3min,每个循环包括94°C变性1min，退火1min，72°C延伸1min,循环结束后于72C延伸10min,扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测以确定扩增效果。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物通过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色检验其多态性。制备8%变性聚丙烯酰胺凝胶，以20W恒定功率电泳60~120min。电泳完毕后，取下凝胶放入固定液(10%冰乙酸+10%乙醇)中固定30min,双蒸水漂洗后转移至0.1%的AgNO3溶液中染色30min,双蒸水漂洗后放入显色液(3.0%NaOH，5mL甲醛)中待条带充分显现后对电泳图谱拍照后分析。1.3.4数据统计与分析根据每个个体产生的条带位置确定其基因型，用Popgen软件分析微卫星位点的有效等位基因数(Ne)、基因观测杂合度(Ho)、基因期望杂合度(He)、群体间遗传相似系数(I)以及遗传距离(Ds)、群体间遗传分化系数(Fst)等指标，采用固定指数Fis评估种群内个体间的近交程度：Fis=1-Ho/He，采用GenAlEx6.2软件对群体内及群体间的分子变异(AMOVA)情况进行分析。2.结果与分析2.1各基因位点的遗传多态性表24个群体中华绒螯蟹在6个微卫星位点上的遗传多态性Tab.2PolymorphicoffourstocksofE.sinensisthe6microsatelliteloci位点参数长江群体辽河群体瓯江群体莱茵河F2locusParameters(CJ)(LH)(OJ)(LYHF2)Ne4.29854.50004.43083.1648He0.80070.81160.80800.5324ES06Ho1.00001.00001.00000.7138Fis-0.3032-0.2857-0.2915-0.3401Ne3.84003.60003.31033.2360He0.77170.75360.72830.7210ES18Ho1.00001.00001.00001.0000Fis-0.3521-0.3846-0.4328-0.4472Ne3.38824.50003.31035.2364He0.73550.81160.72830.8442ES36Ho0.75000.91670.91670.6667Fis-0.0640-0.1786-0.31340.1760Ne3.55562.93883.89193.0638He0.75000.68840.77540.7029ES67Ho0.91671.00000.91670.9167Fis-0.2754-0.5158-0.2336-0.3608Ne4.72133.03164.29853.7403He0.72250.69930.80070.7645ES74Ho1.00000.91670.91670.7500Fis-0.2687-0.3679-0.1946-0.0237Ne3.20002.90913.13043.2727He0.71740.68480.71010.7246ES87Ho0.83330.91670.83330.7500D0.16160.33860.17350.0351Fis-0.2121-0.3968-0.2245-0.0800Ne4.33334.50004.50004.5000MEANHe0.74960.74160.75850.7149Ho0.91670.95840.93060.7995本研究利用6对微卫星引物对4个天然群体共80个个体进行PCR扩增，结果表明（表1），本研究中所涉及的4个中华绒螯蟹群体均具有较高的遗传多样性（总体平均He为0.7411）。4个群体的平均有效等位基因数在4.3333〜4.500之间。各位点上的观察杂合度（Ho）均高于期望杂合度（He）,其中长江群体、辽河群体、瓯江群体和以及莱茵河F2代群体的平均观察杂合度分别为0.9167、0.9584、0.9306、0.7995，平均期望杂合度分别为0.7496、0.7416、0.7585、0.7149。其中瓯江群体的平均期望杂合度最高（平均He为0.7585），莱茵河F2代群体最低（平均He为0.7149），各群体间无显著性差异（P>0.05）。采用固定指数Fis来评估各中华绒螯蟹群体内个体间的近交情况。结果显示，本研究中各中华绒螯蟹群体在6个微卫星位点上的固定指数Fis均为负值，其中辽河群体的平均Fis值最小，为-0.3485，莱茵河F2代的平均Fis值最大，为-0.1669。2.2各群体间的遗传分化本研究中各中华绒螯蟹天然群体间的遗传距离介于0.0688至0.1743之间（表3），其中长江群体与辽河群体间的遗传距离最小（0.0688）,瓯江群体与莱茵河水系F2代群体间的遗传距离最大（0.1743）。本研究中各群体间的平均基因流Nm均大于1,其中长江群体与辽河群体间的Nm最大（20.3629），遗传分化指数Fst最小（0.0121）；瓯江群体与莱茵河F2代之间的基因流Nm最小（7.7421），遗传分化指数Fst最大（0.0313）。总体而言，本研究中各群体间的基因交流比较频繁，各群体间的遗传分化较小。表3中华绒螯蟹4个群体间的遗传距离（Qs）\遗传相似度⑺及基因流（丽）（对角线下）谴传分化系数(Fst)(对角线上)Tab.3Geneticdistances(Ds),geneticsimilarityindices(I)(belowdiagonal),geneflow(Nm)andgeneticdfrentiationcoeficient(Fst)(abovediagonal)amongfOurstocksofE.sinensis群体PopulationsCJLHOJLYHCJ****20.3629/0.01218.3792/0.029014.3851/0.0171LH0.0688/0.9335****8.2252/0.02958.5274/0.0285OJ0.1679/0.84540.1684/0.8450****7.7421/0.0313LYH0.0951/0.90930.1636/0.84910.1743/0.8401****I 长江群体 辽河群体—— 莱茵河咼群体 瓯江群体' 0^005 '图2基于NeZ'遗传距离构建的4个群体的UPGMA树Fig.2UPGMAtreeoffourE.sinensisstocksbasedonNei'sgeneticdistance基于Nei氏遗传距离，用UPGMA法对4个中华绒螯蟹天然群体进行聚类分析（图1）。结果表明，长江群体与辽河群体首先聚为一支，然后与莱茵河F2群体相聚，而瓯江群体单独聚为一支。表4中华绒螯蟹4个野生群体的分子变异分析（AMOVA）Tab.4AMOVAresultsof4E.sinensisstocks变异来源自由度df平方和SS变异组分Va变异贡献率（%）总遗传分化Fst显著性检验P*群体间群体内315.7920.1474.040.04030.02076153.9173.49895.96/总和79169.7083.645100//*P值表示比观察值变异大的概率。*P-valuesaretheprobabilitiesofhavingamoreextremevariancecomponentthantheobservedvaluesalone.将本研究中3个群体作为一组进行分子变异分析（AMOVA分析），分别计算群体内及群体间遗传变异对总遗传变异的贡献率（表4）。结果表明，本研究4个群体间的基因流较大，遗传分化较小（总体Fst为0.0403），其中大部分遗传变异95.96%）存在于各中华绒螯蟹群体内部，存在于群体间的遗传变异较少（4.04%）（PV0.05）。3.讨论3.1各水系中华绒螯蟹的遗传多样性生物的遗传多样性是生命进化和物种分化的基础，在一定程度上决定了该物种在自然或人为条件下对环境改变的适应能力［17］。研究发现，无论在物种水平，还是在群体水平，本研究中各中华绒螯蟹群体均具有较高的遗传多样性，这与Chang［14］、MaHaitao［15以及潘建林等［18］用微卫星技术对中华绒螯蟹所进行的研究结果是一致的。分析其原因可能是，多年来不同水系中华绒螯蟹存在着频繁的群体交流，这种交流一方面加剧了各水系中华绒螯蟹的种质混杂，同时也在一定程度上“提高”了当前各水系中华绒螯蟹的遗传多样性。本研究中莱茵河F2代群体的遗传多样性指数最低，其原因可能是由于该群体从莱茵河水系引入国内的时间较短，其受相近群体“基因污染”的可能性较小；同时，该群体为中华绒螯蟹移居海外后所形成群体的后代，可能由于“奠基者效应”而降低了其遗传多样性指数。3.2各水系中华绒螯蟹群体的遗传结构对几个中华绒螯蟹天然群体间的遗传距离进行分析可知，长江群体与辽河群体间的遗传距离较小，与瓯江群体间的遗传距离较大。本研究各群体间均存在着较高水平的基因交流（Nm值均大于6）。其中长江群体与辽河群体间的基因流最大（20.3629）,由此推测长江群体与辽河群体间的种质混杂更为严重。上世纪60年代发现长江口大眼幼体为中华绒螯蟹蟹苗以来，在包括辽河地区在内的全国均进行了长江水系中华绒螯蟹的人工增殖放流活动，人为导致了长江、辽河等水系中华绒螯蟹群种群间的基因交流。上世纪80年代，由于长江水系中华绒螯蟹苗种资源锐减，辽河水系中华绒螯蟹苗种于1984年起开始被大量引入南方，至此长江、辽河水系中华绒螯蟹群体间的基因交流已十分频繁。上世纪90年代以来，辽河等北方地区的河蟹养殖业发展非常迅速，由于目前辽河水系及丹东至大连沿岸水域已没有具有利用价值的苗汛，相当一部分的种源来自长江流域等南方地区。由于河蟹养殖过程中的逃逸现象较为普遍，推测由此加剧了辽河地区中华绒螯蟹天然群体的种质混杂程度。本研究中瓯江群体与其它几个群体间的遗传距离相对较远，遗传分化相对较大，在UPGMA树上也单独聚为一支。乔新美等对长江、瓯江中华绒螯蟹LDH、MDH、EST等3种同工酶进行研究时曾发现，3种同工酶在长江与瓯江群体的心脏、卵巢等组织中具有较为明显的差异［19］。孙红英等采用16SrDNA对中国大陆绒螯蟹进行系统分化研究时曾在瓯江水系野生群体内发现合浦绒螯蟹所特有的单元型，认为瓯江是中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹两个亚种在地理分布上的过渡地带［20］。由于本研究未同时采集合浦绒螯蟹样本进行分析，因此不能确定瓯江群体是否已与合浦绒螯蟹群体发生种质混杂。李思发等利用RAPD技术对来自欧洲的中华绒螯蟹群体与长江水系中华绒螯蟹群体进行了遗传分析，认为“移居”到欧美的中华绒螯蟹来源于中国的长江水系［21］。王武等比较了莱茵河水系与长江水系中华绒螯蟹的外部特征，通过聚类分析将长江蟹与莱茵蟹划为一组⑸。因此，本研究选取的莱茵河水系F2代群体与长江、辽河以及瓯江群体进行比较研究，研究中发现，长江群体与莱茵河F2代群体间的遗传距离较小，遗传相似度较高，结合两个群体间遗传分化及聚类分析结果，本研究倾向于支持李思发等人的结论，认为莱茵河水系群体与中华绒螯蟹长江群体之间存在较为密切的亲缘关系。固定指数Fis常用来表示群体内个体间的近交系数。当群体内观测杂合度小于期望杂合度，同时Fis为正值时，表明群体内近交程度较严重；女口Fis为负值，同时群体内观测杂合度大于期望杂合度，则表示群体内存在远缘繁殖［17］。本研究中各群体Fis值均为负值，表明本研究所涉及的各中华绒螯蟹天然群体内部均存在着较多的远缘繁殖。分析其原因，可能由于多年来我国各水系中华绒螯蟹无序引种，各水系相应种群间产生了较为频繁的基因交流，从而在各群体内产生了较为明显的远缘繁殖现象。3.3展望各水系中华绒螯蟹种质资源的形成，是生物界长期选择和适应的结果。自上世纪90年代以来，已有许多科研工作者从表型［5-7,9］、染色体水平［22］、蛋白质水平［8,19］及DNA水平［23-25］等层次，对不同水系中华绒螯蟹的种质特征进行了分析研究。这些研究多侧重于分析不同水系中华绒螯蟹的生物学特性、寻找区分不同水系群体的特异遗传标记，以及研究中华绒螯蟹的系统发育等方面，而对当前不同水系中华绒螯蟹群体间的基因交流及遗传分化研究较少。从理论上讲，在不能准确提供上世纪60年代以前各水系中华绒螯蟹样本的情况下，仅利用当前各水系中华绒螯蟹样本所做的遗传特征以及系统发生分析，均不能真实反映各水系中华绒螯蟹在进化历史上所处的地位。在当前中华绒螯蟹种质资源混杂已成事实的情况下，应采用多种手段深入研究当前各水系中华绒螯蟹群体内及群体间的遗传差异，分析不同水系中华绒螯蟹群体间的遗传结构和基因交流情况，评估当前各水系中华绒螯蟹的种质混杂情况，从而为后期长江水系中华绒螯蟹良种选育工作积累资料。参考文献：王成辉，李思发.中华绒螯蟹种质研究进展[J].中国水产科学,2002,9(1):92-96.赵乃刚.长江中华绒螯蟹种质资源混杂对养蟹业的影响[J].内陆水产,1998,5:2-4.谷孝明，赵福顺.长江中华绒螯蟹的资源与养殖现状及其种质保护[J].湖泊科学,2001,13(3):267-271.陈蓝荪,王武,陈再忠.从河蟹市场分析看中华绒螯蟹养殖的发展方向[J].上海水产大学学报,2001,10(1):81-85.王武，张文博，边文冀，陆全平，姚尧.绒螯蟹三个种群形态判别比较[J].水产科技情报,2005,32(2):81-83.许加武，任明荣，李思发.长江、辽河、瓯江中华绒螯蟹种群的形态判别[J]•水产学报,1997,21(3):269-274.李勇，李思发，王成辉，等.三水系中华绒螯蟹形态判别程序的建立和使用[J].水产学报,2001,25(2):120-126.赵金良，李思发.中国大陆沿海六水系绒螯蟹(中华绒螯蟹和日本绒螯蟹)群体亲缘关系:生化遗传差异分析[J].水产学报，1999,23(4):331-335.李晨虹，李思发.中国大陆沿海六水系绒螯蟹(中华绒螯蟹和日本绒螯蟹)群体亲缘关系:形态判别分析[J].水产学报,1999,23(4):337-342.TangBP，KYZhou，DXSong，etal.MolecularsystematicsoftheAsianmittencrabs，genusEriocheir(Crustacea:Brachyura)[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2003，29(2):309-316.谢浩，陆仁后，项超美，等.利用RAPD技术对三种绒螯蟹亲缘关系的研究[J].水生生物学报，1999，23(2):120-125.邱涛，陆仁后，项超美，等.RAPD方法对中华绒螯蟹长江、辽河、瓯江群体的遗传多样性研究[J].淡水渔业,1997,27(5):1-4.高志千，周开亚.中华绒螯蟹遗传变异的RAPD分析[J].生物多样性,1998,6(3):186-190.ChangYM，LiQl，MaHT.MicrosatelliteanalysisofgeneticdiversityandpopulationstructureofChineseMittenCrab(Eriocheirsinensis)[J].J.Genet.Genomics.2008，35:171-176.MaHT，ChangYM，etal.Microsatelliteva