专题三核酸电泳技术课件

专题二核酸电泳技术琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，它用于分离、鉴定和纯化DNA片段。该技术操作简单而迅速，并且能分离用其他方法如密度梯度离心等不能满意分离的DNA片段。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外线激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。琼脂糖凝胶的分离范围很大。50bp到百万bp长的DNA都可以在不同浓度和构型的琼脂糖凝胶中分离。小片段DNA(50～20000bp)最适合在恒定强度和方向的电场中水平方位的琼脂糖凝胶内电泳分离。在这些条件下，DNA泳动速率通常随DNA片段长度的增加而减少，但与电场强度成正比。然而这一简明的相关性当DNA片段长度超过一个最大极限值时立即被破坏，这种情况主要是由于凝胶的构成和电场强度决定的。当线状双螺旋DNA的半径超过凝胶的孔径时就达到它分辨率的极限。此时，DNA不再被凝胶按其大小筛分，而必须以一端在前的方式在介质中迁移，就像通过曲折而又空间有限的管子。这种迁移模式称作“蠕行”。决定DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素DNA分子的大小

双链DNA分子在凝胶基质迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移得越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。琼脂糖浓度

给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DNA电泳迁移率的对数和凝胶浓度之间存在线状相关。

DNA的构象

超螺旋环状(I型)、切口环状(Ⅱ型)和线状(Ⅲ型)DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。上述三种类型的相对迁移率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，但是电流强度、缓冲液离子强度和I型超螺旋绞紧的程度或密度也影响相对迁移率。在一些条件下，I型DNA比Ⅲ型迁移得更快；在另一些条件下，顺序可能颠倒。绝大多数情况下，区分不同构象DNA的需求都很简单，主要是区分未处理的环状DNA样品和单一位点经限制酶作用线状化的同一DNA样品。凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭

溴化乙锭插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。因此线状DNA-染料复合物在凝胶中的迁移率约降低15％。所用的电压

低电压下DNA片段迁移率与所用的电压成正比。电场强度升高时，高分子质量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kbDNA片段的良好分辨率，则所用电压不应高于5～8V／cm。电泳缓冲液

DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子(如用水替代电泳槽及凝胶中的缓冲液)则电导率降至很低，DNA不是全然不动，就是迁移极慢。高离子强度时，如错用了10×电泳缓冲液，电导率升高，即使应用适中的电压也会产生大量的热能。最严重时凝胶会熔化，DNA会变性。琼脂糖标准(高熔点)琼脂糖

制造它的原料是两种海藻，Gelidium和Gracilaria。这两种琼脂糖的凝点和熔点有所不同，但是在实际应用中每种来源的琼脂糖都可以用于分析或分离1-25kb范围的DNA片段。新类型的标准琼脂糖具有高凝胶强度和低电内渗(EEO)，可以灌制浓度低至0.3％的凝胶。这种凝胶用于电泳能方便地分离高分子质量DNA(直到60kb)。它在任何浓度下DNA迁移速度均比通用的标准琼脂糖快10％-20％。这一增加在百万碱基大小DNA的PFGE中将明显地节省时间。低熔点／凝点琼脂糖

通过羟乙基化修饰的琼脂糖在较低的温度熔化，羟乙基化替代的程度决定准确的熔化和凝结温度。低熔点／凝点琼脂糖主要用于DNA的快速回收，因为大多数该类型琼脂糖在65℃熔化，这个温度远低于双链DNA的解链温度。这种特性使它还可以用于DNA的简单纯化和酶处理；在熔化的凝胶中用核酸直接进行细菌转化。化学修饰的琼脂糖比等浓度的标准琼脂糖有更高的筛分能力。该发现使琼脂糖的分辨力接近聚丙烯酰胺凝胶，因此可用于PCR产物、小片段DNA和小RNA(<lkb)的分离。现在它能分辨少至4bp的DNA和分离200-800bp范围内相差2％的DNA片段。电泳缓冲液电泳缓冲液载样缓冲液有三个作用：增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝迁移速率约与长300bp的线状双链DNA相同，而二甲苯氰FF约与长4000bp的DNA相同。上述关系在浓度范围0.5％～1.4％的琼脂糖凝胶中基本不受浓度变化的影响。用哪种载样缓冲液是个人的习惯。DNA大小标准品通常使用已知分子质量的DNA样品，它们是经限制性酶消化已知序列的质粒或噬菌体DNA获得的。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳用的分子质量标准可以从市场购得，或者实验室自己制备。一般最好有两套分子质量范围的标准，一个是1kb到大于20kb的高分子质量标准，一个是100-1000bp的低分子质量标准。分子质量标准贮备液用凝胶载样缓冲液稀释后用于每次电泳实验。溴化乙锭溴化乙锭首先于20世纪50年代合成成功，主要是作为一种有效的杀锥虫制剂而发展起来的菲啶化合物。溴化乙锭在筛选过程中脱颖而出。它的杀锥虫效能是其母化合物的10～50倍，并对小鼠无毒，且与早期的菲啶化合物不同，对牛不具有光致敏作用。直到最近，溴化乙锭在热带及亚热带国家仍被广泛应用于牛锥虫病的治疗和预防。溴化乙锭平面基团的固定位置以及它与碱基的高度临近使被结合的染料所产生的荧光与在自由溶液状态的染料相比增强20～25倍。254nm的紫外线首先被DNA吸收，然后被传送到染料；而302nm以及366nm的射线直接被染料自行吸收。这些被吸收的能量将在590nm的橙红色可见光谱区以0.3的量子产额被重新释放出来。大部分商品化的紫外线光源产生302nm的紫外线。溴化乙锭-DNA复合物在受到紫外线照射激发所产生的荧光，在302nm的紫外线下明显要比366nm的要强，但要比短波紫外线(254nm)的稍弱。然而，302nm紫外线所造成染料的光褪色效应以及造成DNA的断裂和缺口明显要较254nm紫外线少得多。凝胶中DNA的染色溴化乙锭被广泛地用于琼脂糖凝胶中DNA片段的定位，通常将它以0.5μg/ml的浓度被加入到胶中以及电泳缓冲液中。尽管加入溴化乙锭会导致线性双链DNA的电泳迁移率减慢～15％，但却可在紫外灯下直接检查凝胶。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光强度要比未结合的染料强很多，少量的DNA(～10ng／条带)也能从存在游离状态溴化乙锭的凝胶中被检测出来。当需要知道DNA片段的准确大小(如DNA限制酶酶切图谱的鉴定)，凝胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。染色时，将凝胶浸入含有EB(0.5μg/ml)的电泳缓冲液中，室温下染色30～45min。染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量DNA(<10ng)片段时，通常要将染色后的凝胶浸入水中或1mmol/LMgSO4中，室温脱色20min更易观察到。双链DNA的定量分析一种快捷和灵敏的方法是应用溴化乙锭分子的插入可通过紫外线照射产生荧光。由于荧光的亮度与DNA的含量成相关，DNA的含量可通过样品在590nm处的光量度与一系列标准品的对照来估算。琼脂糖凝胶电泳的程序准备好制胶用的模具，置于水平支架或台面上。配制足量的电泳缓冲液(1×TAE或0.5×TBE)用以灌满电泳槽和配制凝胶

配胶和灌满电泳槽使用同一批缓冲液很重要。因为离子强度或pH很小的差别也会在凝胶前部产生紊乱，严重影响DNA片段的泳动。根据欲分离DNA片段大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。

警惕：微波炉加热过长，琼脂糖溶液会变得过热或剧烈沸腾。

仅加热所有琼脂糖颗粒完全溶解需要的最短时间。通常未溶解的琼脂糖呈小透明体或半透明碎片悬浮在溶液中。溶解较高浓度的琼脂糖需要较长的加热时间。要查看煮沸后是否由于蒸发而溶液体积减少，如有必要用水恢复原体积。用隔离手套或夹子转移三角烧瓶或玻璃瓶到55℃水浴。待熔化的凝胶稍冷却后加入溴化乙锭，终浓度为0.5μg/ml。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。琼脂糖溶液正在冷却时，用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置应在托盘底面上0.5～1.0mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。

多数凝胶托盘都有适宜放梳子的侧壁或外侧支架。如果没有或不合适，梳齿可能会太接近托盘底面，在拔出梳子时易穿透加样孔的底部。样品液将从凝胶和加样孔之间泄漏。应用低浓度琼脂糖(<0.6％)或低凝点琼脂糖时这种问题尤其容易发生。浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。

凝胶适宜厚度为3-5mm。需检查在梳齿下或梳齿间应无气泡。用微量移液器及一次性吸头，将样品混合液缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。分子质量标准应分别加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA应向阳极(红色插头)侧泳动。给予1～5V/cm的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。

如电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡，并且几分钟内溴酚蓝从加样孔迁移进入胶