考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量演示文稿

考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量演示文稿现在是1页\一共有20页\编辑于星期四（优选）考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量现在是2页\一共有20页\编辑于星期四【实验原理】

考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。现在是3页\一共有20页\编辑于星期四考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。现在是4页\一共有20页\编辑于星期四蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。现在是5页\一共有20页\编辑于星期四考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。现在是6页\一共有20页\编辑于星期四在一定蛋白质浓度范围内(1～1000µg/ml）,蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

现在是7页\一共有20页\编辑于星期四由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1µg）。现在是8页\一共有20页\编辑于星期四【器材与试剂】（一）器材1.可见光分光光度计2.刻度移液管3.移液枪（二）试剂1.NaCl（0.15mol/L）2.考马斯亮蓝试剂3.蛋白质标准液（1mg/mL）4.待测蛋白质溶液现在是9页\一共有20页\编辑于星期四试管编号0123456待测标准蛋白溶液（mL）00.020.030.040.050.060.100.15mol/LNaCl（mL）0.100.080.070.060.050.040考马斯亮蓝试剂（mL）5555555摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm0？？？？？？现在是10页\一共有20页\编辑于星期四1.如黑板上表格操作2.绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。3.算出待测蛋白质浓度？现在是11页\一共有20页\编辑于星期四【分光光度法的基本原理和分光光度计的使用方法】定义:分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。特点:灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质。应用:生物化学研究中广泛使用的方法之一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定量检测。

现在是12页\一共有20页\编辑于星期四分光光度计的分类

红外分光光度计:可见光分光光度计:紫外分光光度计:测定波长范围为大于760nm的红外光区

测定波长范围为400~760nm的可见光区测定波长范围为200～400nm的紫外光区现在是13页\一共有20页\编辑于星期四可见光谱可见光范围内波长和颜色的关系现在是14页\一共有20页\编辑于星期四分光光度计的基本结构

无论哪一类分光光度计都包括：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示:

入射光强度Io透射光强度I样品池

检测器及仪表单色器光源现在是15页\一共有20页\编辑于星期四光照射到物质上，物质的分子结构决定哪些特定波长的光被吸收。这一现象符合符合朗伯－比耳定律。入射光强度Io样品浓度c光程b透射光强度I当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液(I)现在是16页\一共有20页\编辑于星期四朗伯—比尔定律:

A=lg(1/T)=Kbc

A为吸光度;T为透光度,是透射光强度比上入射光强度（I/I0);c为吸光物质的浓度;b为吸收层厚度(光程）.

物理意义当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的