酶促反应动力学试验

本文格式为Word版，下载可任意编辑——酶促反应动力学试验酶动力学综合试验

试验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定

1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响

2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。1、碱性磷酸酶：

碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本试验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。2、米氏方程：

Michaelis-Menten在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：

错误！未找到引用源。(1)

式中：v表示酶促反应速度，

错误！未找到引用源。表示酶促反应最大速度，[S]表示底物浓度，

错误！未找到引用源。表示米氏常数。

3、错误！未找到引用源。值的测定主要采用图解法，有以下四种：①双曲线作图法（图1-1，a）根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2错误！未找到引用源。时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，由于在试验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测错误！未找到引用源。一个近似值，因而1/2错误！未找到引用源。不确切。此外由于v对[S]的关系呈双曲线，试验数据要求较多，且不易绘制。

②Lineweaver-Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b）实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要便利、确切得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lineweaver-Burk方程式：

错误！未找到引用源。(2)

以错误！未找到引用源。对错误！未找到引用源。作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为错误！未找到引用源。，纵截距为错误！未找到引用源。。把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—错误！未找到引用源。。③Hofstee作图法（略）

把（2）式等号两边乘以错误！未找到引用源。，得：

错误！未找到引用源。(3)

以v对错误！未找到引用源。作图，这时斜率为错误！未找到引用源。，纵截距

为错误！未找到引用源。，横截距为错误！未找到引用源。。④Hanas作图法（略）

把（2）式等号两边乘以[S],得：

错误！未找到引用源。(4)以

对[s]作图，这时斜率为错误！未找到引用源。，纵截距为错误！未找到引用

源。。

（a）(b)

本试验主要以双倒数法，即Lineweaver-Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。具体原理如下：

本试验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适合条件下（PH10.0，和60℃），确凿反应13分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长620nm比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：

然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。

仪器：

1.恒温水浴

2.721型分光光度计

试剂：

1．酚试剂：称钨酸钠（错误！未找到引用源。W错误！未找到引用源。·2错误！未找到引用源。O）100g，钼酸钠（错误！未找到引用源。Mo错误！未找到引用源。·2错误！未找到引用源。O）25g置1500mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再参与硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用蒸馏水稀释一倍，最终酸度为1N。

2．2.5mM磷酸苯二钠基质液：称取625mg磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2?2H2O），溶于1,000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱内可保存一年之久。3．碱性缓冲液（pH10.0）：称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml.

4．碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1mg,加水3~4ml，冰箱内可保存五周左右。

取6支试管按下表参与试剂：1234562.5mM磷酸苯二0.20.40.60.81.01.0钠（ml）蒸馏水（ml）0.80.60.40.2-0.1碱性缓冲液1.01.01.01.01.01.0（ml）混匀后，60℃欲温5分钟碱性磷酸酶液0.10.10.10.10.1-（ml）混匀后，60℃水浴13分钟（确凿计时）注意：1）参与碱性磷酸酶液要快速、确凿。用移液枪加2）此时为酶促反应，总体积2.1ml3）第六管不加酶。酚试剂（ml）1.01.01.01.01.01.010%Na2CO3(ml3.03.03.03.03.03.0)混匀后，室温放置15分钟注意：1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故参与酚试剂后酶促反应即中止。2）Na2CO3提供碱性环境，参与Na2CO3后试剂才显色以6管为调零点，在620nm波优点比色。

1将各管光密度和底物浓度记入下表管号O.D1/O.D[S]1/[S]123452以1/O.D为纵坐标，1/[s]为横坐标，按Lineweaver-Burk作图，求出碱性磷酸酶的Km值。

1）参与碱性磷酸酶的量要确凿2）保温时间要确凿

确凿保温的方法：从第一管参与酶液开始计时，每隔1分钟向下一只试管加酶液,直至加完，到确凿13分钟马上向第一管加酚试剂，以终止其反应，并每隔1分钟向下一只试管加酚试剂,直至加完止，这样保证每管确凿保温13分钟。

1）Km的意义及其影响因子

2）为什么酶促反应速度以初速度表示3）为什么O.D可直接代替V作图4）分析自己的试验数据

试验（二）——温度对酶活性的影响

了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。

每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适合，酶又会全部或部分的恢复其活性。仪器：

1．冰箱2.恒温水浴锅3.试管和试管架4．吸量管及吸量管架5.移液枪及枪头6.胶头滴管7．烧杯

试剂：

1．PH6.8的缓冲液：量取15.45ml的0.2M磷酸氢二钠和4.55ml的柠檬酸混合摇匀即可。2．0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠，溶于100ml蒸馏水（需加热）。3．0．03175g/L碘液

4．1MHCl溶液5.1MNaOH溶液6.稀释100倍的唾液7.冰水浴

1．制管和预温由于本试验对恒温反应要求较高，故每个温度梯度使用两支试管，分别标记为A管和B管，同时欲温底物与酶。A管参与PH6.8的缓冲液和0.5%淀粉液；B管使用移液枪参与稀释100倍的唾液，相对应的两支试管置于设定的温度下预温5min。

取12支清白试管，参照下表参与试剂：管号1（0℃）2（室温）3（37℃）4（50℃）5（70℃）6（室温）PH6.8的222222缓冲液（ml）A含NaCl用2ml的0.5%22222的蒸馏淀粉液水代替（ml）稀释100B倍的唾111111液（ml）*6号管为对照组（比色时作为0号管），置于室温，且淀粉液用蒸馏水代替

2．混合A、B管将1号A管试剂迅速参与温度对应的B管中(为了最大限度保证酶的量)，此时为计时的起点（使用秒表），摇匀后放回对应温度继续水浴。注意：转移A管试剂前需将其摇匀。3．时间控制然后每隔1min或2min（时间自定）按上步操作依次把2、3、4、5、6号的A、B管混合，严格控制好时间。4．中止反应确凿反应13min，向1号管参与2滴1MHCl溶液，马上混匀，中止反应，按上一步的顺序和时间间隔依次对各管进行操作，并移至试管架。后再各用2滴1MNaOH溶液中和每管。5．显色在每管中各参与2ml0.03175g/L碘液并混匀，观测现象。6．比色若不同温度梯度间现象区别不明显，则进行比色，通过光密度值来比较。

记录现象（或比较吸光度值），做出合理分析。

严格注意时间的控制及各物质的添加量。假使某同学（没有严格依照教案步骤）做出的试验结果为唾液淀粉酶的最适温度为70度，请分析他得出这样的结果的可能原因。

试验（三）——PH对酶活性的影响

了解PH对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。

1.PH对酶活性影响的机理：PH影响酶活性中心的某些必需基团的解离,而这些基团往往仅在某一解离状态时才最简单同底物结合或具有最大催化活性；PH影响可解离基团的底物和辅酶的荷电状态,从而影响酶对他们的亲和力；PH还可以影响酶活性中心的空间构象,从而影响酶的活性。

2.本试验用唾液淀粉酶为材料来观测酶活性受PH的影响的状况。淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解,从而得到各种糊精乃至麦芽糖,少量葡萄糖等水解产物。碘液与淀粉及其不同程度的水解产物反应浮现不同颜色,即淀粉(蓝色)、紫色糊精(紫色)、红色糊精(红色)、麦芽糖及少量葡萄糖(黄色)。仪器：

1、冰箱2、电炉3、恒温水浴锅4、试管架及试管

5、移液管架及移液管

试剂：

1、0.2M磷酸氢二钠溶液：称取35.61g含2个结晶水的磷酸氢二钠，用水定容至1L。

2、0.1M柠檬酸溶液：称取21.01g含一个结晶水的柠檬酸，用水定容至1L。3、唾液淀粉酶：将唾液分别稀释10倍、50倍和100倍，得三种不同浓度的酶液、

4、0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠，溶于100ml蒸馏水（需加热）。

5、0.1%淀粉液：0.1g可溶性淀粉，加到100ml蒸馏水中，加热溶解。6、碘液：15g碘化钾和12.7g碘，加少许水使碘完全溶解后，再用水稀释至200ml。

7、1%氯化钠溶液。8、0.1%硫酸铜溶液。

（一）PH对酶活性的影响1、缓冲溶液的配制

取六只清白的三角烧瓶，按表1编号和加试剂：

表1磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制

试验（三）——PH对酶活性的影响

了解PH对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。

1.PH对酶活性影响的机理：PH影响酶活性中心的某些必需基团的解离,而这些基团往往仅在某一解离状态时才最简单同底物结合或具有最大催化活性；PH影响可解离基团的底物和辅酶的荷电状态,从而影响酶对他们的亲和力；PH还可以影响酶活性中心的空间构象,从而影响酶的活性。

2.本试验用唾液淀粉酶为材料来观测酶活性受PH的影响的状况。淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解,从而得到各种糊精乃至麦芽糖,少量葡萄糖等水解产物。碘液与淀粉及其不同程度的水解产物反应浮现不同颜色,即淀粉(蓝色)、紫色糊精(紫色)、红色糊精(红色)、麦芽糖及少量葡萄糖(黄色)。仪器：

1、冰箱2、电炉3、恒温水浴锅4、试管架及试管

5、移液管架及移液管

试剂：

1、0.2M磷酸氢二钠溶液：称取35.61g含2个结晶水的磷酸氢二钠，用水定容至1L。

2、0.1M柠檬酸溶液：称取21.01g含一个结晶水的柠檬酸，用水定容至1L。3、唾液淀粉酶：将唾液分别稀释10倍、