神经培养技术12090714课件

神经培养技术简介体外培养（invitroculture）包括：

组织培养（tissueculture）细胞培养（cellculture）器官培养（organculture）就是将活体结构成分（如活体组织、细胞或者器官等）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。萌芽：1885年德国学者Roux将鸡胚的神经板放入生理盐水中，发现神经板在盐水内存活数天。起步：1907年，Harrison首次成功地用蛙淋巴液培养了蛙胚神经组织，并观察到神经细胞突起的生长过程。神经培养的发展历史人类神经系统被公认为是自然界最复杂的系统。神经科学（neuroscience）已成为当今人类医学和生命科学的前沿。多个学科、多个研究领域所进行的研究，均能以神经培养作为研究手段之一。神经培养与神经科学一、按培养物的整体性及大小分类

细胞分散培养（dissociatedculture）器官-组织型培养（器官型培养）（organotypicalculture）神经培养的分类可直接按培养的对象命名：如小脑培养，神经节培养，星形胶质细胞培养，少突胶质细胞培养，雪旺细胞培养等。二、按培养的对象分类原代培养（primaryculture）：神经细胞一般不再分裂，不传代，故属原代培养。再培养（sub-culture）：把培养物切、割、取、弃等修改后，换培养液后再继续培养。联合培养（coculture）：把两种或两种以上的组织放在一起进行培养。四、其它

按开创研究者的名字命名，如Maximow双盖片法。在培养液中专门加入某种激素、神经生长因子或某些药物而标以某某特殊培养。五、以上方式的综合或特殊设计的培养综合上述数种方式的培养或培养与移植相结合的特殊设计的培养等。一、无污染环境

二、温度

37℃

三、气体环境和氢离子浓度

95%空气和5%二氧化碳

pH值为7.2~7.4神经培养所需的环境条件半固体培养基液体培养基①天然培养基（naturalmedium）②合成培养基（syntheticmedium）③无血清培养基（serumfreemedium）六、培养基

①玻璃 ①多聚赖氨酸覆着底物②一次性塑料 ②细胞外基质成分 ③细胞粘附分子 ④单层非神经元细胞七、培养器皿和附着底物神经培养的基本实验设备

一般包括：准备室无菌操作室缓冲间进行其它操作的实验间

一、神经培养室的建立三、器械

四、培养器皿

1.玻璃器皿2.塑料器皿培养用液平衡盐溶液（BalancedSaltSolution,BSS）天然培养基（NaturalMedium）合成培养基（SyntheticMedium）其它几种常用平衡盐溶液的组成成分（g/L）

1.血清牛血清成年牛血清新生牛血清胎牛血清马血清羊血清二、天然培养基

2.胚胎浸出液：鸡胚浸出液、牛胚浸出液内含有生长因子、大分子核蛋白和小分子氨基酸等，有促进细胞生长的作用。四、无血清培养基以合成培养基配成基础培养液，再补加其它成分。1.基础培养液HamF12和DMEM混合培养液DMEM/F12(1:1)神经元基础培养基（neurobasalmedium）2.生长附加成分比较通用的：胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠、孕酮、腐胺（丁二胺）B-27、N-2（Gibco）

②胶原酶溶液（collagenasesolution）对胶原有强的消化作用，适于消化成年的背根神经节等纤维较多的组织。此酶作用缓和，且无须机械震荡。Ca2+、Mg2+和血清存在下仍有活性。

③EDTA溶液EDTA（二乙胺四乙酸二钠）是一种化学螯合剂，对细胞有一定的离解作用，毒性小，价格低廉，使用方便。2.pH调整液①NaHCO3液7.4%、5.6%、3.7%②HEPES液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）终浓度10~50mmol/L3.抗生素液①青霉素100U/ml②链霉素100μg/ml4.谷氨酰胺溶液常配成100倍（200mmol/L）终浓度1~4mmol/L5.有丝分裂抑制剂①阿糖胞苷（ara-c）3~5μg/ml②5-氟脱氧尿嘧啶神经培养的基本技术程序培养前准备新鲜组织取材培养接种标本维持观察记录培养前准备

1.实验室准备2.器皿准备3.液体准备4.动物准备取材新鲜、无菌动作轻柔，切忌损伤组织熟练，操作时间过长会增加污染机会取材时要滴加平衡盐溶液以防干燥培养接种包括组织块接种和单细胞悬液接种。

器官-组织型培养组织不能太大，通常以薄片形式，厚度一般不超过1mm。

细胞分散培养细胞分散培养是从20世纪50年代才逐渐开展起来的。神经细胞分散培养则开始于1952年由Moscona进行的鸡视网膜细胞的分离培养。神经组织的分离分散细胞的目的在于使细胞之间的连接解离，制成单细胞悬液。常用的分散细胞的方法有：机械分散法和消化分离法。

标本维持37℃5%CO2培养箱

更换培养液一般2~3天观察记录肉眼或放大镜下观察倒置相差显微镜观察电子显微镜观察新生大鼠基底神经节神经元的分散培养取新生1天大鼠1只，75﹪酒精棉球消毒后取心脏处死。剪除头颅处皮肤，充分暴露颅顶骨。于颅顶骨基底环状剪开，小心去除，切勿损伤脑组织。从后内侧向前外侧用眼科镊小心翻去大脑皮层，暴露基底神经节。小心夹取基底神经节组织，放入有1mlD-Hanks液的小烧杯内，眼科剪剪成1mm3组织块。把组织块移到离心管内，吸除多余的D-Hanks液后用0.125﹪胰酶1ml37℃消化30min。时间不定50μl胎牛血清终止消化，滴管小心吹打，打散组织。200目铜网过滤，离心1000r/min5min。弃上清，用含10﹪胎牛血清DMEM