毒理学试验指导

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试验一半衰期的测定-比色法测定水杨酸钠的血浆半衰期

试验二兔血液红细胞计数

试验三四氯化碳对家兔肝脏谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶

(GOT)的影响试验

*所需试验仪器：电子天平、水浴锅、pH计（试纸）、显微镜、分光光度计、离心机、

一次性注射器。

1

试验一半衰期的测定-比色法测定水杨酸钠的血浆半衰期

一、原理、目的

药物血浆半衰期t1/2即血浆药物浓度下降一半所需的时间。绝大多数药物是按一级动力学规律消除（恒比消除），因此每种药物都有固定的t1/2，不因血浆浓度高低而改变。本试验用分光光度法测定水杨酸钠的血浆浓度并计算t1/2。水杨酸钠为抗炎药，经肝代谢，在酸性环境中与三氯化铁生成一种紫色的络合物，在520nm波长下比色，其光密度与水杨酸浓度成正比。

通过测定水杨酸钠的血浆半衰期，使学生了解水杨酸钠在体内的消除速度，并把握其血浆半衰期的测定方法。半衰期是判断毒物蓄积程度的重要参数，对中毒和解毒有一定的实践意义。

二、试剂、器材及动物

离心管、试管、磅秤、玻璃棒、注射器、吸管、离心机、721型分光光度计；三氯醋酸、水杨酸钠、三氯化铁；兔。三、方法步骤

1、取离心管和试管各5支，分别标为1~5号，备用。5支离心管各参与10％三氯醋酸7ml。

2、取兔1只，称体重，从耳静脉取血2ml置入1号离心管，用玻璃棒搅拌。然而自耳静脉注入10%水杨酸钠(剂量为150mg/kg)，并马上和60min后两次自另一耳静脉取血2ml，分别注入2、3号离心管中，搅拌。4、5号离心管分别参与蒸馏水和0.02%水杨酸钠2ml。

3、取上述5支离心管进行离心(2000r/min，5min)，确凿吸取上清液6ml放入编号相对应的试管中，分别滴入10%三氯化铁12滴(0.6m1)摇匀5min后比色。

4、用721型分光光度计520nm波长比色，以4号管调“0〞，读得5号管光密度为x，再以1号管调“0〞，读得2号管为x1，3号管为x2，将上述操作归纳为下表：

水杨酸钠血浆半衰期的测定

试管名编号对照

马上60min空白标准

5、计算半衰期

①求k值：k=y/x;y=0.02

②求水杨酸钠血浓度：给药后马上血浓度y1=kxl；给药后60min血浓度y2=kx2。③根据以下公式求半衰期：

12345

三氯醋酸（ml）

77777

兔血0.02%水杨酸钠蒸馏水（ml）（ml）（ml）222——

————2

———2—

离心上清液三氯化铁（ml）（gtt）

66666

1212121212

0.301t1/2=

四、结果

(lgy1-lgy2)/t结果测定

5号管光密度（x）

2号管光密度（x1）

3号管光密度（x2）

t1/2

2

试验二血液红细胞、白细胞计数

A

红细胞计数（redbloodcellcount，RBC）是指计算每升血液内所含红细胞的数目。红细胞计数的方法有显微镜计数法、血沉管计数法、光电比色法、血细胞电子计数器计数法等。目前在临床上使用最广泛的是显微镜计数法（计数板法）。

一、原理

血液经稀释后，充入血细胞计数板，用显微镜观测，计数一定容积内的红细胞数并换算成每μl内的数目。

二、器材

1、改良式血细胞计数板：临床上最常用的是改良纽巴（Neubauer）氏计数板，它是由一块特制的玻璃板构成，玻璃板中间有横沟将其分为三个狭窄的平台，两边的平台较中间的平台高0.1mm。中央平台又有一纵沟相隔，其上各刻有一个计数室。每个计数室划分为9个大方格，每一大方格面积为1.0mm2，深度为0.1mm；四角每一大方格划分为16个中方格，为计数白细胞用。中央一大方格用双线划分为25个中方格，每个中方格又划分为16个小方格，共计400个小方格，此为红细胞计数之用。

2、血盖片：专用于计数板的盖玻片呈长方形，厚度为0.4mm。

3、沙利氏（shali）吸血管或红细胞稀释管，5ml吸管、中试管。

4、显微镜，计数器等。5、稀释液：0.85％氯化钠溶液。三、方法试管稀释法

用5ml吸管吸取红细胞稀释液3.98ml（或4ml亦可）置于试管中。用沙利氏吸血管吸取全血样品至20μl刻度处（或吸血至刻度10处，红细胞稀释液用2ml）。擦去吸管外壁多余的血液，将此血液吹入试管底部，再吸、吹数次，以洗出沙利氏管内粘附的血细胞，然后试管口加塞，颠倒混合数

3

次，再用毛细吸管（或玻棒）吸取已稀释好的血液，放于计数室与盖玻片接触处，即可自然流入计数室中。注意充液不可过多或过少，过多则溢出而流入两侧槽内，过少则计数池中形成气泡，致使无法计数。

计数时，先用低倍镜，光线要稍暗些，找到计数室的格后，把中央的大方格置于视野之中，然后转用高倍镜。在此中央大方格内选择四角与最中的五个中方格（或用对角线的方法数五个中方格），每个中方格有16个小方格，所以共计数80个小方格。计数时注意压在左边双线上的红细胞计在内，压在右边双线上的红细胞则不计数在内；同样，压在上线的计入，压在下线的不计入，此所谓“数左不数右，数上不数下〞的计数法则。

四、计算

R/80×400×200×10=1mm3血液中红细胞个数。R—5个中方格（即80个小方格）内的红细胞总数。400—一个大方格，即1mm2面积内共有400个小方格。200—稀释倍数。

10—血盖片与计数板的实际高度是1/10mm，乘10后则为1.0mm。上式简化后为R×10，000=红细胞数/mm3

推算后即：每升血液中的红细胞数M=R×1010(200倍稀释)

五、本卷须知

（1）红细胞计数是一项细致的工作，稍有马虎大意，就会引起计数不准。关键是防凝、防溶、取样正确。取抗凝血时，抗凝剂的量要适合，不可过少使血液部分呈小块凝集；采血时应注意及时将抗凝剂与血液混匀。防溶是指防止过分振摇而使红细胞溶解，或是器材用水洗后未用生理盐水冲洗而发生溶血，使计数结果偏低。取样正确是指吸血10或20μl一定要确凿，吸血管外的血液要擦去，吸血管内的血液要全部洗入稀释液中，稀释液的用量要准；充液量不可过多或过少，过多可使血盖片浮起，过少则计数室中形成小的空气泡，使计数结果偏低甚至无法计数。此外，显微镜台未保持水平，使计数室内的液体流向一侧，这些操作上的错误均可使计数结果不确凿。

（2）器材清洗方法：沙利氏吸血管或试管，每次用完后，先用清水吸吹数次，然后用蒸馏水、酒精、乙醚，按次序分别吸吹数次，干后备下次使用。血细胞计数板用蒸馏水冲洗后，用绒布轻轻擦干即可，切不可用粗布擦试，也不可用酒精、乙醚等溶液冲洗。

六、参考值

家兔：(5.87±0.32)×1012/L；

成人男性：(4.0-5.5)×1012/L；成人女性：(3.5－5.0)×1012/L

4

试验三四氯化碳对肝脏谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)

的影响试验

一、目的要求

通过本试验使学生把握四氯化碳对肝脏谷丙转氨酶(GPT)/丙氨酸氨基转移酶(ALT)和谷草转氨酶(GOT)/门冬氨酸氨基转移酶(AST)影响的测定方法。

二、原理

谷氨酸+丙酮酸GPT/ALT-酮戊二酸+丙氨酸以丙氨酸和α-酮戊二酸为基质，在一定条件下反应产生一定量的丙酮酸，参与1摩尔浓度酸后酶反应终止，2，4-二硝基苯肼与丙酮酸作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙，在碱性条件下呈红棕色，根据色泽深浅推算出酶活力。虽然基质中剩余的α-酮戊二酸也能与2，4-二硝基苯肼生成苯腙，但在500~520nm波长下，丙酮酸2，4-二硝基苯腙的显色强度约为α-酮戊二酸2，4-二硝基苯腙的3倍，且α-酮戊二酸的用量较少，利用这一区别可以反映丙酮酸的生成量。

GOT/AST

谷氨酸+草酰乙酸-酮戊二酸+门冬氨酸

T

以门冬氨酸和α-酮戊二酸为基质，在一定条件下反应产生一定量的草酰乙酸，草酰乙酸在反应过程中又自行脱羧成为丙酮酸，余下与2，4-二硝基苯肼的显色原理同ALT。

三、试剂与器材及动物1．试剂

(1)磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.4)：取甲液420ml和乙液80ml，混合均匀即得。

①甲液(0.1mol/L磷酸二氢钠）：取NaH2PO4·12H2O35.82g，加蒸馏水溶解后稀释至1000ml。②乙液（0.1mol/L磷酸二氢钾）：取无水KH2PO413.61g，加蒸馏水溶解后稀释至l000ml。(2)丙酮酸钠标准液（2mmol/L）：在100ml磷酸盐缓冲液中溶解22.0mg丙酮酸钠。(3)0.4mol/L氢氧化钠溶液：先配1mol/LNaOH{(称取NaOH40g，用蒸馏水溶解后稀释至1000ml即得)，以1mol/LNaOH稀释配成0.4mol/LNaOH。

(4)SGPT基质液：确切称取DL-丙氨酸1.79g和α-酮戊二酸29.2mg，放于100ml烧杯内，参与少量(约15m1)磷酸盐缓冲液及少量1mol/L的NaOH溶液使其溶解，并调pH至7.4，放入100ml容量瓶内，用磷酸盐缓冲液定容，4℃冰箱保存，此液每升含α-酮戊二酸2mmol、丙氨酸200mmol。(5)SGOT基质液：在100ml的烧杯中参与29.2mgα-酮戊二酸和2.66gDL-天门冬氨酸，再参与足量的1mol/L氢氧化钠，配成溶液，用1mol/L氢氧化钠调理pH为7.4，移入100mg容量瓶中，用磷酸盐缓冲液定容，4℃温箱保存。此液每升含α-酮戊二酸2mmol、天门冬氨酸200mmol。

(6)2,4-二硝基苯肼液(1mmol/L)：称取19.8mg2,4-二硝基苯肼，加1mol/L盐酸至100ml使之成为溶液。盛于棕色瓶内备用。(7)50％四氯化碳植物油溶液。

2．器材

分光光度计、注射器、试管、兔笼。3．动物

健康、未妊娠的家兔。

四、方法步骤

1．损伤兔肝脏取健康、未妊娠家兔以50％四氯化碳植物油溶液股内皮下注射（0.5m1/kg）

5

损害其肝脏。

2．制备血清取损伤肝24h后的家兔全血入清白试管中，静置后取其血清。同法制取健康家兔的血清（对照），均置入冰箱保存待用。3．标准曲线的绘制SGOT和SGPT不能用一个标准曲线，在作标准曲线时，应分别参与基质液，按表1操作。

表1SGOT和SGPT标准曲线制作步骤单位：ml

试剂

0.1mol/L磷酸盐缓冲液丙酮酸钠标准液(2mmol/L)SGPT/SGOT基质液相当于丙酮酸实际含量(mol)相当于GPT活力(IU)相当于GOT活力(IU)2,4-二硝基苯肼液0.4mol/L氢氧化钠

空白0.1000.500000.505.0

10.100.050.450.1028240.505.0

20.100.100.400.2057610.505.0

30.100.150.350.30971140.505.0

40.100.200.300.401501900.505.0

50.100.250.250.502000.505.0

置37℃水浴中预热5min置37℃水浴中保温20min

混匀，37℃保温10min后取出，冷却至室温，于520nm处进行比色，以蒸馏水调“0〞读取各管光密度。将各管光密度减去“空白〞管光密度，所得差值与其对应的酶活力单位数作图。标准曲线应作2~4套，求其均值较为理想。

4．测定鼠肝脏谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性(1)取清白试管3支，各标以“肝损〞、“正常对照〞、“水对照〞，分别确凿参与SGPT基质液或SGOT基质液各1.0ml。

(2)将试管置于37℃恒温水浴中温热2~3min。然后在“肝损