重组体的筛选公开课课件

第八章重组体的筛选检测

一、核酸分子的遗传学与物理检测法二、免疫化学与核酸序列分析法1将目的DNA片段与载体连接形成重组子，然后通过各种方法将重组子导入宿主细胞，得到所需要的带有重组DNA的转化子，这是基因工程的目的所在。2转化子：导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。重组子的鉴定可以从直接和间接两个方面分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同水平进行鉴定。3一、遗传学检测法1、根据载体表型特征的筛选（1）抗药性标记插入失活筛选法第一节核酸分子的遗传学与物理检测法5克隆Kan抗性基因6（2）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法7蓝白菌落筛选白色菌落92、根据插入基因遗传性状的筛选重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就可以利用营养突变株进行筛选。10合成某一aa的基因载体酶切连接重组缺少该aa合成酶基因的菌株转化只缺少该aa的基本培养基筛选重组子生长、获得11核酸杂交方法：

菌落印迹原位（insitu）杂交斑点（dot）印迹杂交Southern印迹杂交都是通过一定的物理方法将菌落（噬菌斑）或突起的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同液体中的探针进行杂交。131、菌落印迹原位杂交将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态14实验步骤15

肺腺癌β-catmRNA原位杂交法×400

172、斑点印迹杂交

★斑点印迹杂交与菌落原位杂交的原理相同

★将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上

★优点：简单、快速、可同时检测多个样品

★常用于病毒核酸的定量检测18RNA或DNA变性NC膜固定杂交放射自显影检测实验原理与步骤提取碱溶液点样加热放射性探针一定条件X-底片显影、定影标记斑点193、Southern印迹杂交

★1975年，英国Southern创建★DNA与DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。21带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜实验步骤22白瓷盘玻璃板滤纸凝胶尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板重物吸水纸转膜2325264、直接凝胶电泳检测法利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。分子量Marker载体重组克隆2930实验步骤3132

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

335、酶切电泳筛选法原理根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果。34ABA或B3536不同克隆的酶切结果37筛选过程38第二节免疫化学与核酸分析法利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法1.抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”

39待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白125I标记的二抗402.放射性抗体检测法过程4142二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。1.原理抗原——抗体凝集反应。检测分泌型产物。2.方法43对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。44三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbantassay1.原理：一抗（primaryantibody）:

与目标分子的特异结合。二抗（secondaryantibody）：

与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linke）：

二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。45待测基因产物蛋白一抗二抗酶

待测基因产物蛋白一抗二抗无色的底物有色的产物比色观察酶

46472.ELISA的局限性有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（monoclonalantibody）48四、Westernblotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。①Western（转膜）胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。膜胶蛋白49Western装置50②Blotting原理与ELISA相同。待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗辣根过氧化物酶底物产物，并发出光PAGE胶待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶：HRPO51521）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与

膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。4）清洗掉未结合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。③Blotting过程53④结果多克隆抗体Blotting的结果单抗blotting结果54检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性优点：可形象地展示出特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域五、DNaseⅠ足迹实验（footprintingassay）5532p15