杂交瘤技术与单克隆抗体公开课课件

第12章杂交瘤技术与单克隆抗体新民周刊2010,5.17-23.P76-92010.11.2：世界肺炎日（第2个）全球每年约有160万人死于肺炎链球菌疾病，平均每38秒1名5岁下儿童死于此病，1100万儿童因肺炎住院。中国是10个肺炎发病率最高的国家之一，1/4儿童携带病菌；死亡儿童该病占46.8%。占西太平洋区的70%。红霉素不敏感几乎达到100%，青霉素达86%。1983年23价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗PPV23诞生。2000年针对2岁以下儿童的7价肺炎链球菌蛋白结合疫苗PPV7问世。目前已经接种3亿剂，世界第一大单个疫苗。2003年SARS病毒SARS病毒属于冠状病毒科，病毒粒子多呈圆形，有囊膜，外周有冠状排列的纤突，病毒直径在80-120nm之间。感染病毒的细胞线粒体肿胀，部分线粒体外膜或嵴溶解，病毒颗粒主要分布在胞浆的内质网池、胞浆空泡内和细胞外，多聚集成堆。12-1

杂交瘤技术将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到即能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通称为杂交瘤技术（hydridomatechnique）。历史发现1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。科勒（Kohler）米尔斯坦（Milstein）（一）免疫学基础1抗原：进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。特点：结构表位性（抗原决定簇

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单克隆抗体免疫原特异性：（抗原与抗体的反应）抗原---刺激免疫系统---发生免疫应答-----产生应答产物。18T细胞与B细胞抗原决定簇的比较2抗体互补性决定区（Complementaritydeterminingregion，CDR）VH和VL的三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位。该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面，决定抗体的多样性与特异性。动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的物质，存在于血清中，本质是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。•C：constantregion•V：variableregion抗体的来源免疫系统：包括体液免疫和细胞免疫，参与的细胞包括B淋巴细胞——发育成浆细胞，分泌抗体，参与体液免疫，脾脏可以分泌。T淋巴细胞——发育成吞噬细胞，直接参与细胞免疫，经胸腺分泌。不能产生抗体，帮助B淋巴细胞产生抗体。问题的引出血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须采用其他方法。3单克隆抗体生产途径：细胞融合：杂交瘤细胞病毒转化：获得永久生长的B淋巴细胞视频：d_XMTY1ODg5MDI0.html(三）杂交瘤制备单克隆抗体单克隆抗体技术分非特异性、特异性两类2.骨髓瘤细胞株的培养与筛选骨髓瘤细胞系应和免疫B淋巴细胞源于同一品系动物（如BALB/C小鼠），这样杂交融合率高。通常采用HPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）与TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞系。HPRT和TK两种酶参与DNA补救途径合成。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，用老鼠巨噬细胞作饲养层进行培养，取对数生长期骨髓瘤细胞，进行HAT液敏感性筛选培养。HAT培养基筛选法培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字头称为HAT培养基。HAT筛选原理DNA的合成：正常途径：糖、氨基酸——核苷酸——DNA，可以被氨基蝶呤阻断胸腺嘧啶核苷激酶（TK）补救途径：核苷酸前体——核苷酸——DNA

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）需要2种酶的参与4融合细胞的筛选融合的B淋巴细胞和瘤（杂交瘤）细胞、融合的B淋巴细胞、融合的瘤细胞、未融合的B淋巴细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体等。正常的B淋巴细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。剩余：B淋巴细胞与瘤细胞的杂交瘤细胞+未融合的瘤细胞+融合的瘤细胞，其中后两种需进行特别的HAT液培养筛选去除。融合后的细胞类型：（1）氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，因此HAT培养基上的细胞不能采用该途径合成DNA。（2）融合的瘤细胞一般是HPRT与TK缺陷型，因此也不能采用补救途径合成DNA。两条途径被阻断后，有怎样的结果呢？瘤细胞（未融合的和多聚体）命运：因不能正常合成DNA而死亡。融合杂交瘤细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞内的HPRT与TK，因此可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成DNA，因此可在HAT培养基中存活与繁殖。HAT筛选杂交瘤细胞H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶5.杂交瘤细胞的克隆化培养将融合的杂交瘤细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的数个细胞之间，培养。取上清以ELISA法筛选出针对目标抗原的抗体分泌性高的杂交瘤细胞株，增殖后冻存。7.单克隆抗体的大量制备（1）血清法对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107cells／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。缺点是采血量有限。（一）体内接种法（2）腹水制备法腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5～20mg/ml，这是目前最常用的方法。人—鼠杂交瘤：融合方法基本与鼠—鼠杂交瘤相同。亲本骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞，亲本B细胞则来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。但是，人—鼠杂交瘤的人单克隆抗体分泌性能很不稳定，多数情况下杂交瘤会很快失去抗体分泌能力