第6章物质的能量转换1线粒体

第一节线粒体与氧化磷酸化线粒体被称为细胞内的能量工厂。人体内的细胞每天要合成几千克的ATP，95%是由线粒体中的呼吸链所产生。线粒体通过氧化磷酸化，进行能量转换。现在是1页\一共有95页\编辑于星期四线粒体发现及功能研究简史1890年Altaman发现线粒体,命名为bioblast。1898年Benda将这种颗命名为mitochondrion。1900年L.Michaelis发现线粒体具有氧化作用。1948年Green证实线粒体含所有三羧酸循环的酶。1949年Kennedy发现脂肪酸氧化是在线粒体内完成。1976年Hatefi等纯化了呼吸链四个独立的复合体。1961-1980年Mitchell提出氧化磷酸化化学偶联学说。现在是2页\一共有95页\编辑于星期四一、线粒体的形态结构（一）形态、大小、数量和分布1.形态：粒状或杆状，因种类和生理状态，可呈环形，哑铃形、线状、分杈状。2.大小：直径0.5~1μm，长1.5~3.0μm，胰脏分泌细胞中可长达10~20μm，称巨线粒体。人成纤维细胞则更长，可达40μm。线粒体形状与大小也随着代谢条件不同而改变。现在是3页\一共有95页\编辑于星期四3.数量：不同类型细胞中M相差大，有的仅1个，有的数百或数千，同类型细胞中数目稳定。在代谢活跃的细胞中数量多；植物常较动物少；红细胞中无线粒体。4.分布：常均匀分布在胞质，但也有不均匀分布，常集中在代谢活跃的区域。M常结合在微管上，可向功能旺盛区域迁移。现在是4页\一共有95页\编辑于星期四线粒体大小和数量反映了细胞能量需求

线粒体位于心肌细胞和精子尾部需能多的部位现在是5页\一共有95页\编辑于星期四活细胞中线粒体形态高度可变

现在是6页\一共有95页\编辑于星期四（二）线粒体的结构线粒体由内外两层单位膜封闭形成，包括外膜、内膜、膜间隙和基质4个部分。现在是7页\一共有95页\编辑于星期四线粒体结构模型

现在是8页\一共有95页\编辑于星期四1、外膜(outmembrane)全封闭的单位膜，厚6nm，脂和蛋白含量近相等;具孔蛋白(porin)构成的亲水通道，分子量<5KD分子可通过。外膜通透性较高，膜间隙环境和cytosol中相似。具一些特殊酶类，如色氨酸降解的酶、脂肪链延伸的酶。标志酶为单胺氧化酶。现在是9页\一共有95页\编辑于星期四2、内膜（innermembrane）厚约6-8nm，通透性低，仅让不带电荷小分子通过，大分子和离子通过内膜需特殊转运系统。蛋白质/脂类>3:1。心磷脂含量20%、无胆固醇。氧化磷酸化的电子传递链位于内膜。现在是10页\一共有95页\编辑于星期四内膜向基质褶入形成嵴(cristae)，嵴有2种类型：①板层状；②管状。多呈板层状。嵴上有基粒，基粒由头部(F1)和基部(F0)构成，F0嵌入内膜。内膜具丰富的酶，主要是参与电子传递与ATP合成的酶类，及参与运输与合成的酶类，标志酶为细胞色素C氧化酶。现在是11页\一共有95页\编辑于星期四板层状结构现在是12页\一共有95页\编辑于星期四管状嵴线粒体

现在是13页\一共有95页\编辑于星期四3、膜间隙(intermembranespace)宽6-8nm，含大量可溶性酶、底物和辅助因子膜间隙的pH值与胞质相似。标志酶为腺苷酸激酶，催化ATP分子的末端磷酸基团转移到AMP现在是14页\一共有95页\编辑于星期四4、基质（matrix）除糖酵解外，其它生物氧化的酶均在基质中：TCA循环、脂肪酸和丙酮酸氧化的酶。标志酶为苹果酸脱氢酶。含一套完整的转录和翻译体系：mtDNA，70S核糖体，tRNA、rRNA、DNA聚合酶、氨基酸活化酶等。现在是15页\一共有95页\编辑于星期四二、线粒体的功能是糖类、脂肪和氨基酸最终的氧化场所。物质先在胞质中经一系列降解形成丙酮酸和脂肪酸，进入线粒体，再经一系列分解形成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环。主要功能是进行氧化磷酸化，合成ATP现在是16页\一共有95页\编辑于星期四(一)真核细胞中的氧化作用(oxidation)葡萄糖和脂肪酸是真核细胞能量的主要来源。1.糖的氧化:分为3个阶段：1)在胞质中，糖氧化生成丙酮酸；2)丙酮酸进入线粒体，脱羧生成乙酰CoA3)乙酰CoA进入TCA循环，彻底氧化现在是17页\一共有95页\编辑于星期四2.脂肪的氧化：在胞质中水解成脂肪酸，脂肪酸进入线粒体基质，通过β氧化途径生成乙酰CoA，及1分子NADH和FADH2。乙酰辅酶A是线粒体能量代谢的核心分子。现在是18页\一共有95页\编辑于星期四3.TCA循环：乙酰CoA和草酰乙酸结合成一个含3个羧酸的柠檬酸，柠檬酸经氧化脱羧，经酮戊二酸、琥珀酸，降解成草酰乙酸，每循环一次生成2分子CO2、一分子GTP、4分子NADH和一分子FADH2。现在是19页\一共有95页\编辑于星期四4.辅酶在能量传递中的作用:TCA循环的净产物是FADH2和NADH，含循环中底物氧化释放的电子，共5对，可用于ATP合成。胞质糖酵解也产生NADH，可通过苹果酸-天门冬氨酸穿梭和甘油-磷酸穿梭，将电子传递给线粒体的FAD，形成FADH2，参与ATP合成。现在是20页\一共有95页\编辑于星期四(二)呼吸链与电子传递呼吸链(respiratorychain)，是内膜上的一组酶复合体。功能是进行电子、H+的传递及氧的利用，产生H2O和ATP。TCA循环后，大部分能量储在NADH和FADH2中，需将还原型辅酶氧化才能将能量释放出，该过程涉及电子从NADH或FADH2传递到氧。现在是21页\一共有95页\编辑于星期四在内膜中一系列的电子载体进行的电子传递过程中，NADH或FADH2所含能量逐步释放，最后储存在ATP的高能磷酸键中。电子经呼吸链流动称电子传递，ADP转变成ATP称磷酸化，两者的偶联即氧化磷酸化。现在是22页\一共有95页\编辑于星期四（三）氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)的分子基础

现在是23页\一共有95页\编辑于星期四1、电子载体与电子结合并将其传递下去的物质:电子载体。呼吸链电子载体：黄素蛋白、细胞色素、铜原子、铁硫蛋白、辅酶Q。(1)

NAD：烟酰胺嘌呤二核苷酸，脱氢酶的辅酶，连接TCA循环和呼吸链，将氢交给黄素蛋白。现在是24页\一共有95页\编辑于星期四NAD的结构和功能:NAD＋：R＝H，NADP＋：R＝H2PO3-

现在是25页\一共有95页\编辑于星期四(2)黄素蛋白(flavoprotein)：由一条多肽链结合一个辅基组成的酶类,辅基为FMN或FAD，每个FMN或FAD可接受2个电子和2个质子。呼吸链上有以FMN为辅基的NADH脱氢酶，以FAD为辅基的琥珀酸脱氢酶。现在是26页\一共有95页\编辑于星期四

FMN(flavinmononucleotide)的分子结构现在是27页\一共有95页\编辑于星期四FAD(flavinadeninedinucleotide)的分子结构

现在是28页\一共有95页\编辑于星期四(3)细胞色素(cytochrome)：含血红素铁，以Fe3+和Fe2+互变传递电子，呼吸链中有5类细胞色素:a、a3、b、c、c1；a、a3含铜原子。血红素基团的铁可传递单个电子aa3分子中,还含2个铜原子,靠其化合价的变化,把电子从a3传递到氧现在是29页\一共有95页\编辑于星期四血红素的结构

现在是30页\一共有95页\编辑于星期四(4)

铁硫蛋白(Fe/Sprotein)：属细胞色素类，分子中央结合的是铁和硫，非血红素，称铁硫中心。一般含4个原子，2个铁和2个S，称2Fe-2S，也有4Fe-4S。也是通过Fe2+、Fe3+互变进行电子传递，且一次只能传递1个电子

现在是31页\一共有95页\编辑于星期四现在是32页\一共有95页\编辑于星期四(5)辅酶Q(coenzymeQ)：脂溶性小分子醌类化合物，通过氧化和还原传递电子。有3种氧化还原形式：氧化型醌Q，还原型氢醌(QH2)和介于两者间的半醌(QH)。每个醌能接受和传递2个电子和质子现在是33页\一共有95页\编辑于星期四

辅酶Q

现在是34页\一共有95页\编辑于星期四2、氧化还原电位与载体排列顺序同种物质得失电子的两种状态称氧还对。如NAD+和NADH，两者间有电位差，即氧还电位可在标准条件下测定标准氧还电位。标准氧还电位越小，提供电子的能力越强通过测定电子载体的氧化还原电位，可推断其在呼吸链中的排列顺序现在是35页\一共有95页\编辑于星期四3、电子传递复合物用脱氧胆酸(离子型去污剂)处理内膜、分离出呼吸链的4种复合物，即复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，辅酶Q和细胞色素C不属于任何一种复合物。辅酶Q溶于内膜，细胞色素C位于内膜的膜间隙侧(C侧)，属膜外周蛋白。现在是36页\一共有95页\编辑于星期四（1）复合物ⅠNADH脱氢酶，哺乳动物中由42条肽链组成。含1个FMN和6个Fe/S，以二聚体存在。作用：催化NADH的2个电子传至辅酶Q，并将4个H+由基质(M侧)→膜间隙(C侧)。电子传递方向：NADH→FMN→Fe-S→Q结果：NADH+5H+(M)+Q→NAD++QH2+4H+(C)现在是37页\一共有95页\编辑于星期四（2）复合物Ⅱ琥珀酸脱氢酶，4条肽链，含1个FAD，2个Fe/S传递低能电子，催化电子从琥珀酸→CoQ，传递过程：琥珀酸→FAD→Fe-S→Q。不转移质子。反应结果为：琥珀酸+Q→延胡索酸+QH2现在是38页\一共有95页\编辑于星期四（3）复合物ⅢCoQ-cytc还原酶，由11条不同肽链组成，以二聚体存在，单体含2个cytb(b562，b566)、一个cytc1和一个Fe/S。作用：催化电子从辅酶Q→cytc，每转移一对电子，同时将4个H+转移至膜间隙。结果：2氧化态cytc1+QH2+2H+(M)→2还原态cytc1+Q+4H+(C)现在是39页\一共有95页\编辑于星期四复合物Ⅲ的电子传递和“Q循环”有关辅酶Q能在膜中自由扩散，在内膜C侧，QH2将一个电子交给Fe-S→细胞色素c1→细胞色素c，被氧化为半醌(QH)，并将一个质子释放到膜间隙，半醌将电子交给细胞色素b566→b562，释放另外一个质子到膜间隙。cytb566得到的电子为循环电子，传递路线为：半醌→b566→b562→辅酶Q。在内膜M侧，辅酶Q可被复合体Ⅰ（复合体Ⅱ）或cytb562还原为氢醌。一对电子由辅酶Q到复合物Ⅲ的电子传递过程中，共有四个质子被转移到膜间隙，其中两个质子是辅酶Q转移的。现在是40页\一共有95页\编辑于星期四Q循环示意图

现在是41页\一共有95页\编辑于星期四（4）复合物Ⅳcytc氧化酶，以二聚体存在，单体含1个cyta、a3和2个Cu原子。作用：将电子从cytc→氧。传递路线：cytc→CuA→hemea→a3-CuB→O2每转移一对电子，从基质中摄取4个H+，其中2个用于水形成，另2个被转至膜间隙。结果：

4还原态cytc+8H+(M)+O2→4氧化态cytc+4H+(C)+2H2O现在是42页\一共有95页\编辑于星期四4、两条主要的呼吸链呼吸链传递的主要是NADH，而FADH2较少，可将呼吸链分为主、次两条：主链由复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组成，催化NADH氧化次链由复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组成，催化琥珀酸氧化现在是43页\一共有95页\编辑于星期四两条主要的呼吸链现在是44页\一共有95页\编辑于星期四A.Molecularbasisofoxidation:Electron-transportchain现在是45页\一共有95页\编辑于星期四（二）ATP合酶(ATPsynthetase)的结构和作用机理F0F1-ATP酶，是生物能量转化的核心酶。参与氧化磷酸化和光合磷酸化，催化合成ATP。也存在线粒体内膜、叶绿体类囊体膜、异氧菌和光合菌质膜上。膜结合状态下具有ATP合成活性，分离状态下具水解ATP的活性。现在是46页\一共有95页\编辑于星期四1.ATP合酶的结构(1)F1:由5种多肽组成的九聚体(3α3βγδε)，α和β单位交替排列，如桔瓣。γ贯穿αβ复合体，并与F0接触，ε帮助γ与F0结合。δ与F0的两个b亚基形成固定αβ复合体的结构。具3个ATP合成催化位点,每个β亚基一个。(2)F0:由3个亚基组成的15聚体(1a:2b:12c)。c亚基在膜中形成物质运动的环，b亚基与δ固定F1；a亚基是质子通道。现在是47页\一共有95页\编辑于星期四ATP合酶的结构F1:5subunitsintheratio3:3:1:1:1F0:1a：2b：12c

现在是48页\一共有95页\编辑于星期四F1和F0通过转子和定子联系起来，在合成或水解ATP时，转子在通过F0的H+推动下,依次与3个β亚基作用，调节β亚基催化位点构象变化；定子在一侧将α3β3与F0连接起来。F0的作用之一,利用跨膜质子势转换成扭力矩，推动转子旋转.现在是49页\一共有95页\编辑于星期四现在是50页\一共有95页\编辑于星期四2.氧化磷酸化与电子传递的偶联呼吸链中有3个部位自由能变化较大，是呼吸链氧化还原放能与ATP合成偶联部位，可被特异性抑制剂阻断。复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ每传递一对电子，释放的自由能都足够合成1分子ATP，这三个复合物是呼吸链中电子传递与氧化磷酸化偶联的3个位点，各处生成1分子ATP。NADH呼吸链有3个偶联位点，可生成3个ATP.FADH2呼吸链只合成2分子ATP，因为复合物Ⅱ不是ATP合成的偶联位点。现在是51页\一共有95页\编辑于星期四SummaryofthemajoractivitiesduringaerobicrespirationinamitochondrionNADHO2:3ATP/2e;FADH2O2:2ATP/2e现在是52页\一共有95页\编辑于星期四3.生物氧化产生ATP的统计一个葡萄糖分子经细胞呼吸全过程产生的ATP

糖酵解：底物水平磷酸化产生4ATP（胞质）

己糖分子活化消耗2ATP（胞质）

产生2NADH，经电子传递产生4或6ATP净积累6或8ATP

丙酮酸氧化脱羧：产生2NADH(M)，生成6ATP

三羧酸循环：底物水平的磷酸化产生(M)2ATP；

产生6NADH（M），生成18ATP；

产生2FADH2（M），生成4ATP

总计生成36或38ATP

现在是53页\一共有95页\编辑于星期四（三）氧化磷酸化的偶联机理氧化与磷酸化的偶联机制一直是研究氧化磷酸化作用的关键主要的假说有：1、化学渗透学说(chemiosmoticcouplinghypothesis)2、构象偶联假说(conformationalcouplinghypothesis)现在是54页\一共有95页\编辑于星期四1、化学渗透假说：质子动力势MitchellP.1961提出“化学渗透假说(ChemiosmoticHypothesis)”，70年代化学渗透假说得到大量实验的支持，成为一种较为流行的假说，Mitchell也因此获得1978年诺贝尔化学奖。现在是55页\一共有95页\编辑于星期四化学渗透学说：电子沿呼吸链传递时，释放的能量将质子从内膜基质侧泵至膜间隙，线粒体内膜对离子高度不通透，使膜间隙的H+浓度高于基质，在内膜两侧形成pH梯度(△pH)及电位梯度(Ψ)，共同构成电化学梯度，即质子动力势(△P)。

△P=Ψ-(2.3RT/F)△pH

T为绝对温度，R为气体常数，F为法拉第常数质子沿电化学梯度穿过内膜上的ATP合酶流回基质，使ATP合酶构象改变，将ADP和Pi合成ATP现在是56页\一共有95页\编辑于星期四

化学渗透学说现在是57页\一共有95页\编辑于星期四现在是58页\一共有95页\编辑于星期四Mithchell’sChemiosmotictheory(1961)Morethan21026molecules(>160kg)ofATPperdayinourbodies.现在是59页\一共有95页\编辑于星期四Otherrolesfortheproton-motiveforceinadditiontoATPsynthase现在是60页\一共有95页\编辑于星期四2、构象耦联假说1979年Boyer提出构象耦联假说，要点有：1．ATP酶利用质子动力势，产生构象的改变，改变与底物的亲和力，催化ADP与Pi形成ATP。2．F1有三个催化位点，三个催化位点的构象不同、与核苷酸的亲和力不同。在L构象(loose)，ADP、Pi与酶疏松结合；在T(tight)构象与酶紧密结合；在O构象(open)ATP与酶的亲和力低，被释放。3．质子通过F0时，引起c亚基构成的环旋转，带动γ亚基旋转，γ亚基端部高度不对称，它的旋转引起β亚基3个催化位点构象的周期性变化(L、T、O)。每个亚基要经过3次构象改变才能催化合成1个ATP。现在是61页\一共有95页\编辑于星期四现在是62页\一共有95页\编辑于星期四现在是63页\一共有95页\编辑于星期四TheATPsynthaseisareversiblecouplingdevice

现在是64页\一共有95页\编辑于星期四支持构象耦联假说的实验有：1．日本的吉田（MassasukeYoshida）等人将α3β3γ固定在玻片上，在γ亚基的顶端连接荧光标记的肌动蛋白纤维，在含有ATP的溶液中温育时，在显微镜下可观察到γ亚基带动肌动蛋白纤维旋转。2．在另外一个实验中，将荧光标记的肌动蛋白连接到ATP合酶的F0亚基上，在ATP存在时同样可以观察到肌动蛋白的旋转。现在是65页\一共有95页\编辑于星期四γ亚基旋转的观察现在是66页\一共有95页\编辑于星期四（四）氧化磷酸化抑制剂电子传递抑制剂可用来研究呼吸链各组分的排列顺序，当呼吸链某一特定部位被抑制，底物一侧均为还原态，另一侧均为氧化态，可用分光光度计检测，各组分氧化态和还原态具不同的吸收峰。1.电子传递抑制剂:包括以下类型：①抑制NADH→CoQ电子传递:阿米妥、鱼藤酮、杀粉蝶素A。②抑制Cytb→Cytc1电子传递:抗霉素A③抑制细胞色素氧化酶→O2:CO，CN，NaN3，H2S现在是67页\一共有95页\编辑于星期四2．磷酸化抑制剂:与F0结合结合，阻断H+通道，从而抑制ATP合成：寡霉素、二环己基碳化二亚胺(DCC)3．解偶联剂(uncoupler):使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可进行，而磷酸化不能进行。解偶联剂为离子载体或通道，能增大内膜对H+通透性，消除H+梯度，无ATP生成，使氧化释放出的能量全部以热的形式散发动物棕色脂肪组织和肌肉线粒体中有独特的解偶联蛋白，与维持体温有关。现在是68页\一共有95页\编辑于星期四常用解偶联剂主要有：质子载体：2，4-二硝基酚(DNP)，羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)。质子通道:增温素。其它离子载体：缬氨霉素。某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体温升高。现在是69页\一共有95页\编辑于星期四三、线粒体的半自主性63年发现线粒体DNA(mtDNA)后，又在线粒体发现RNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶、tRNA、核糖体等进行DNA复制、转录和蛋白质翻译的全套装备，说明线粒体具独立遗传体系。线粒体能合成蛋白质，但合成能力有限。线粒体1000多种蛋白质中，自身合成的仅十余种。线粒体核糖体蛋白、氨酰tRNA合成酶、许多结构蛋白，都是核基因编码，在胞质中合成，定向转运到线粒体，故称线粒体为半自主细胞器。现在是70页\一共有95页\编辑于星期四利用标记氨基酸培养细胞，用氯霉素和放线菌酮分别抑制线粒体和胞质蛋白质合成，发现人的mtDNA编码的多肽为细胞色素c氧化酶的3个亚基，F0的2个亚基，NADH脱氢酶的7个亚基和细胞色素b等13条多肽。mtDNA还合成12S和16SrRNA及22种tRNA。现在是71页\一共有95页\编辑于星期四mtDNA分子为环状双链DNA，外环为重链(H)，内环为轻链（L）。基因排列非常紧凑，大多数基因无内含子序列。基因组变化较大，动物细胞mtDNA较小，约16.5kb，酵母达80kb。每个细胞含几百个线粒体，每个线粒体又含多个mtDNA，但mtDNA的总量不到核基因组的1%.现在是72页\一共有95页\编辑于星期四多数基因由H链转录，包括2个rRNA，14个tRNA和12个编码多肽的mRNA。L链编码另外8个tRNA和一条多肽链。mtDNA上的基因相互连接，一些多肽基因相互重叠，几乎所有阅读框都缺少非翻译区域。很多基因没有完整的终止密码，仅以T或TA结尾，mRNA终止信号是在转录后加工加上去现在是73页\一共有95页\编辑于星期四GenesinmtDNAencoderRNAs,tRNAs,andsomemitochondrialproteinsHumanmtDNA:16,569bp2rRNAs,22tRNAs,13polypeptides:NADHreductase.7sub.Ctyb-c1complex.1cytbCytoxidase.3subunitsATPsynthase:2F0sub

现在是74页\一共有95页\编辑于星期四线粒体在形态、染色反应、化学组成、物理性质、遗传体系等