怎样选择色谱柱液相色谱柱的种类与方法开发

怎样选择色谱柱液相色谱柱的种类与方法开发第1页，共39页，2023年，2月20日，星期四内容概要色谱基本概念回顾色谱柱类型、选择和方法开发第2页，共39页，2023年，2月20日，星期四色谱基本概念回顾

第3页，共39页，2023年，2月20日，星期四色谱（chromatography）色谱原理色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相色谱功能：分析（种类/定量），纯化液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检测器（流通池）第4页，共39页，2023年，2月20日，星期四分离度

Rs-ResolutionN–TheoreticalPlateNumberα–Selectivityk–RetentionFactor拖尾第5页，共39页，2023年，2月20日，星期四1.SeparationofCompoundsAandB第6页，共39页，2023年，2月20日，星期四灵敏度ＬＯＤ：LimitofDetectionＬＯＱ：LimitofQuantification

－柱效－峰形（拖尾因子）

第7页，共39页，2023年，2月20日，星期四重现性分离度（Ｒ）－保留时间（Ｖ，Ｔ，Ｋ）－选择性（α）－柱效（Ｎ）灵敏度

第8页，共39页，2023年，2月20日，星期四色谱柱类型、选择和方法开发第9页，共39页，2023年，2月20日，星期四色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响分离度《

-选择性〈键合类型，基质表面特性；流动相、温度

-柱效〈保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相，温度，上样量，流速峰对称性《基质表面特性，键合类型，流动相，温度保留体积《柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键合类型；流动相，温度灵敏度《粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度稳定性和重现性《基质表面特性，键合类型；流动相，温度流动相《

pH，缓冲盐种类，溶剂；第10页，共39页，2023年，2月20日，星期四影响色谱柱性能的主要因素1、色谱柱的构型

色谱柱内径色谱柱长度2、

固定相柱填料粒径比表面积孔径孔隙率基质表面特性：

-表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量-耐碱性键合类型-官能团、是否封尾

-键合相的保留行为、耐酸性第11页，共39页，2023年，2月20日，星期四色谱柱的构型对色谱柱性能的影响第12页，共39页，2023年，2月20日，星期四色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径色谱柱尺寸对色谱分离的影响：•短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低

•长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长

•窄径柱(2.1mm)–满足检测器和样品量限制

•宽径柱(3-7.8mm)-载样量高，抗污染，寿命

制备柱

(内径>10mm)–用于纯化制备第13页，共39页，2023年，2月20日，星期四柱填料对色谱柱性能的影响第14页，共39页，2023年，2月20日，星期四柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径

硅胶粒径和类型对柱效的影响d硅胶粒径和类型对压力的影响第15页，共39页，2023年，2月20日，星期四柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II

目前市场主要可供选择的填料粒径1.7μm，1.8μm，2.2μm－快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪

2.7μm－多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo)3.0μm，3.5μm－普通快速分析5.0μm－常规分析颗粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱压升高.第16页，共39页，2023年，2月20日，星期四柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积

每克填料的表面积，与粒度，孔径有关比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)根据需要选择合适的比表面积第17页，共39页，2023年，2月20日，星期四柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I

多孔材料的95%以上表面在孔内部样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部孔径至少是样品流体学直径的4倍

300Ǻ孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部第18页，共39页，2023年，2月20日，星期四柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II

由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大条件： C8色谱柱，4.6×150mm， 3.5um，A溶剂，0.1%TFA水溶液；B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈－

水中；20min梯度，10 30%B；60°C， 1.5ml/min第19页，共39页，2023年，2月20日，星期四柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I2.3-二羟基萘2.7-二羟基萘TF=1.31BrandW,AQColumn5μm,4.6mm×150mm

BrandZ,C18Column5μm,4.6mm×150mm

VenusilMPC185μm,4.6mm×150mmBrandH,C18Column5μm,4.6mm×150mmBrandU,C18Column5μm,4.6mm×150mm！TF=1.42TF=1.39TF=1.69TF=？流动相：

甲醇：水=65：35流速：

1mL/min温度： 35℃检测波长： 230nm进样量： 20μL硅胶纯度－金属含量第20页，共39页，2023年，2月20日，星期四硅胶基质类型及发展史TypeA：原料来源：水玻璃；高金属含量，高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附TypeB：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅烷）水解/烧结/酸洗杂化及表面杂化整体柱壳层柱第21页，共39页，2023年，2月20日，星期四柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II

硅胶纯度－金属含量d第22页，共39页，2023年，2月20日，星期四固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响残余硅羟基的影响普通硅胶当流动相的pH值大于4.5-5.0时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。解决方法封尾双层表面修饰表面杂化第23页，共39页，2023年，2月20日，星期四固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响封尾键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率。缺点：不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被反应）在pH<3时，TMS易流失，耐用性，稳定性不好TMS第24页，共39页，2023年，2月20日，星期四固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响第25页，共39页，2023年，2月20日，星期四固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响双层表面修饰降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀第26页，共39页，2023年，2月20日，星期四固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响硅胶双层表面修饰后

新增加表面层硅羟基活性更低－新硅羟基pH=5.2，普通硅羟基pH约为3.5更对称的峰型，提高柱效，提高灵敏度

硅胶表面更均匀－硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖重现性更好

表面纯度更高－硅胶金属杂质被覆盖极性化合物保留和分离更好第27页，共39页，2023年，2月20日，星期四键性化合物峰形对比

Testconditions:Columndimension:4.6mmx150mmSample:doxepin,nortriptyline,trimipramineamitriptylineMobilephase:Acetonitrile/0.01Msodiumphosphate(pH=6)=70/30Temperature:30oCFlow:1mL/minDetection:UV254nmBrandAC18(non-endcapped,)C18(non-endcapped,twin-layer第28页，共39页，2023年，2月20日，星期四ASBC18ZorbaxSBC18SaponinsExtract

4.6x150mmcolumn,1%formicacid/MeOH=80/20第29页，共39页，2023年，2月20日，星期四固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响双层表面修饰代表产品：StableBondC18，PolarBondC18，SurfBondC180.01ng/mLPseudoephedrineAUMIBauloStableBondC18,2.1×50mm,5µmBrand

A

C182.1×50mm,5µmPhenomenexLunaC18,2.0×50mm,5µm第30页，共39页，2023年，2月20日，星期四固定相对色谱柱性能的影响：键合类型A纵向交联：保留和选择不稳定B横向交联：宽pH适用C单体键合：重现性好，柱效高D单体（空间保护）：低pH稳定Ｅ极性官能团嵌合反相固定相第31页，共39页，2023年，2月20日，星期四固定相对色谱柱性能的影响：

基质表面特性+键合类型〉反相键合相的保留行为同一厂家相同硅胶基质的反相柱：

保留值随含碳量的增加而增加比表面积越大，保留值越大键合碳链越长，保留越大C18

C8>C3>C1，长链之间差别不大≈第32页，共39页，2023年，2月20日，星期四反相键合相的保留行为不同厂家色谱柱的保留值，选择性与峰型色谱柱：4.6*150mm，流动相：乙腈－0.05M磷酸钾缓冲液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，拖尾峰T0（尿嘧啶）P:

吡啶L:

苯酚N:

N,N-二甲基苯胺

B:

4-丁基苯甲酸J:

甲苯第33页，共39页，2023年，2月20日，星期四固定相对色谱柱性能的影响：

基质表面特性+键合类型〉键合相的稳定性键合相的稳定性

低pH值，键合相流失高pH值，硅胶溶解影响色谱柱寿命，方法不重现

第34页，共39页，2023年，2月20日，星期四键合类型对键合相稳定性影响低pH值，键合相流失第35页，共39页，2023年，2月20日，星期四键合类型对键合相稳定性影响（II）空间位阻保护，延缓键合相流失第36页，共39页，2023年，2月20日，星期四固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性高pH