微生物的实验室培养

微生物的实验室培养第1页，共38页，2023年，2月20日，星期四微生物的类群原生生物原核生物真菌病毒如酵母菌单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等微生物包含了除植物界和动物界以外的所有生物无细胞结构真核细胞细菌、蓝藻原核细胞第2页，共38页，2023年，2月20日，星期四课题1微生物的实验室培养专题2:微生物的培养与应用第3页，共38页，2023年，2月20日，星期四课题背景19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中，出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研究，法国科学家巴斯德发现导致生产失败的根源在于发酵物中混入了杂菌。由此人们意识到保持培养物纯净的重要性。防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。第4页，共38页，2023年，2月20日，星期四一、基础知识：（一）培养基

人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。1.培养基的类型（1）按物理状态来分：

固体培养基、液体培养基、半固体培养基（2）按成分来分：天然培养基、合成培养基（3）按功能来分：

基础培养基、选择培养基、鉴别培养基(微生物生存的环境和营养物质)第5页，共38页，2023年，2月20日，星期四按成分不同划分天然培养基合成培养基化学成分不明确的天然有机物用于工业生产化学成分明确的物质配制而成的培养基用于分类和鉴定分类第6页，共38页，2023年，2月20日，星期四按物理状态不同划分固体培养基液体培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0%琼脂含量一般为0.2%-0.7%不加任何凝固剂半固体培养基进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏进行观察微生物的运动特征、分类鉴定大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究第7页，共38页，2023年，2月20日，星期四按用途不同划分基础培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基选择培养基微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长第8页，共38页，2023年，2月20日，星期四微生物需要的四大类营养要素物质（二）培养基的构成1.碳源2.氮源3.无机盐4.水凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。⑴概念：⑵不同微生物所利用的碳源不同：1.微生物的碳源异养型微生物的碳源为：含碳有机物（有机碳）自养型微生物的碳源为：含碳无机物（无机碳）第9页，共38页，2023年，2月20日，星期四①无机氮源②有机氮源凡是能够为微生物提供N元素的营养物质。2.微生物的氮源⑴概念：⑵来源：⑶固氮微生物所利用的氮源是：3.特殊要求培养基还需要满足微生物生长的pH、特殊营养物质。

例如:生长因子：微生物生长不可缺少的微量有机物维生素、某些氨基酸、碱基氮气第10页，共38页，2023年，2月20日，星期四1000mL牛肉膏蛋白胨固体培养基配方培养基组分提供的主要营养牛肉膏5.0g碳源、氮源、磷酸盐和维生素蛋白胨10.0g氮源和维生素NaCl5.0g无机盐H2O

定容至1000ml氢元素、氧元素牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类。的水溶性物质。牛肉膏为微生物提供碳源、氮源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素。第11页，共38页，2023年，2月20日，星期四（三）培养基配制原则：（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。细菌pH为：6.5-7.5（中性或微碱性）；放线菌pH为：7.5-8.5；真菌pH为：5.0-6.0（偏酸型）。第12页，共38页，2023年，2月20日，星期四二、无菌技术1.无菌技术

（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌技术，主要包括以下几个方面：第13页，共38页，2023年，2月20日，星期四消毒：指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分的微生物（不包括芽孢和孢子）。2.消毒与灭菌

灭菌：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而达到完全无菌的过程。提示：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。讨论2：无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？第14页，共38页，2023年，2月20日，星期四煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min化学药剂消毒法:用70%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源紫外线消毒(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法第15页，共38页，2023年，2月20日，星期四1、灼烧灭菌---接种工具的灭菌(2)灭菌的方法：第16页，共38页，2023年，2月20日，星期四2、干热灭菌：

160-170℃下加热1-2h。主要对能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等进行灭菌。3、高压蒸气灭菌：

100kPa、121℃下，维持15-30min。培养基灭菌。第17页，共38页，2023年，2月20日，星期四讨论3：请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手提示：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。第18页，共38页，2023年，2月20日，星期四（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.计算：（根据微生物生长时对营养物质的需求）物质牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水重量5g10g5g20g定溶至1000mL2.称量

准确称取各种成分，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。三、实验操作思考：该培养基从物理性质分属于哪种？原因？含有几种营养成分？牛肉膏提供上述哪几种成分？第19页，共38页，2023年，2月20日，星期四

3.溶化：

先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，不断用玻璃棒搅拌，原因：防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。待溶解后，加自来水定溶至100mL。（熔化后灭菌前应该调节PH)

4.灭菌：将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），连同培养皿（3～5套，用几层报纸包好）一起放到高压蒸汽灭菌锅内灭菌。

5.倒平板：待培养基冷却到50OC左右时倒平板。第20页，共38页，2023年，2月20日，星期四倒平板技术第21页，共38页，2023年，2月20日，星期四

1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论

答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。第22页，共38页，2023年，2月20日，星期四3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。第23页，共38页，2023年，2月20日，星期四（二）纯化大肠杆菌：1.纯化的方法：（1）平板划线法：

通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，在数次画线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的子细胞群体，这就是菌落。（2）稀释涂布平板法：

将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落。第24页，共38页，2023年，2月20日，星期四将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_______在_______旁冷却接种环，并打开棉塞将试管口通过火焰.将已______的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划__________条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。.将试管通过火焰，并塞上棉塞火焰冷却三至五灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_______开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。末端烧红将平板_____放入培养箱中培养。

倒置第25页，共38页，2023年，2月20日，星期四第26页，共38页，2023年，2月20日，星期四微生物的恒温培养第27页，共38页，2023年，2月20日，星期四平板划线时不能划破培养基的原因：一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。第28页，共38页，2023年，2月20日，星期四问题讨论

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第29页，共38页，2023年，2月20日，星期四

2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。

3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第30页，共38页，2023年，2月20日，星期四

2.稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。

在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。第31页，共38页，2023年，2月20日，星期四系列稀释操作101102103104105106

(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。

(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。

(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试管中，重复步骤2，直至到第六支试管。第32页，共38页，2023年，2月20日，星期四将涂布器浸在盛有70％酒精的烧杯中取少量（不超0.1mL）稀释液滴加到培养基表面灼烧待酒精燃尽后冷却8～10s

涂布将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀涂布平板操作第33页，共38页，2023年，2月20日，星期四稀释涂布平板法获取的菌落第34页，共38页，2023年，2月20日，星期四（三）菌种的保存搁置斜面

1.试管低温临时保藏将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔3～6个月要重新接种培养后再保存）。

2.甘油管长期保藏在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高压灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的冷冻箱中保存。第35页，共38页，2023年，2月20日，星