生物化学第一章蛋白质课件

第一章蛋白质的结构与功能

StructureandFunctionofProtein蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。Protein一：蛋白质概述二：氨基酸三：肽与肽键四：蛋白质的分子结构五：蛋白质的分子结构与功能关系六：蛋白质的重要性质七：蛋白质的分类

“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断地自我更新”。恩格斯《反杜林论》(1878年)∴蛋白体≈核酸＋Pr（结合蛋白质:核蛋白）2.蛋白体？含量多：

湿重：约占体重的17－22%；

干重：约占细胞干重45%3.为什么说：蛋白质是生命的物质基础？种类多：一个大肠杆菌：＞3000种一个真核细胞：数千种

人体内蛋白质：＞

10万种

生物界：约1百亿种主要表现在：

参与构成各种细胞及组织

参与体内的物质代谢、细胞信号的转导及生理功能的调节控制

特殊功能:催化、运输、储存、凝血与纤溶、识别、免疫等等

氧化供能:17.15kJ/g蛋白质功能多：

二.蛋白质的分子组成元素组成：

1、主要元素：碳、氢、氧、氮和硫，有些蛋白质还含有少量磷和金属元素。碳50％氢7％氧23％氮16%硫0—4％其他微量(磷、铁、碘、锌和铜)2、特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均含氮量为16%。3、定氮法测定蛋白质含量：蛋白质含量＝6.25×样品含氮量应用：微量凯氏定氮法

凯氏定氮法实验原理：蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。三、蛋白质的基本结构单位──氨基酸(一)、氨基酸的通式(二)、二十种常见的蛋白质氨基酸分类、结构及三字符号(三)、氨基酸的性质蛋白质水解蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解.完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。所以，氨基酸是蛋白质的基本结构单元。大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。这20种氨基酸被称为基本氨基酸。20种氨基酸(一)、氨基酸的结构氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，因而称为α-氨基酸

COOHH2NCHα-碳原子基团RR基团α-氨基酸基本结构通式手性碳原子：连接四个不同的原子或基团。手性分子：与自身镜像不能重叠的分子。旋光度：偏振光旋转的角度α。比旋光度：：旋光度：质量浓度(g/ml)：测定时的温度：光源的波长：盛液管的长度（dm）构型和命名法D,L-构型表示法：

羟基在碳链右边的为D型，它的对映体为L型。D-甘油醛L-甘油醛凡可以从D-甘油醛通过化学反应而得到的化合物，或可以转变成D-甘油醛的化合物，都具有与D-甘油醛相同的构型，即D型。与L-甘油醛的相同构型的化合物则是L型。除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。各种氨基酸的区别在于侧链R基的不同。-氨基酸可变部分不变部分Aminoacid氨基酸的结构

（1）中性氨基酸甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine（1）中性氨基酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine亮氨酸

Leucine异亮氨酸

Ileucine甲硫氨酸

Methionine

（2）含硫氨基酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine亮氨酸

Leucine异亮氨酸

Ileucine甲硫氨酸

Methionine半胱氨酸

Cysteine（2）含硫氨基酸氨基酸的结构

丝氨酸

Serine

（3）

含羟基氨基酸氨基酸的结构

丝氨酸

Serine苏氨酸

Threonine

（3）含羟基氨基酸氨基酸的结构

（4）碱性氨基酸精氨酸

Arginine氨基酸的结构

（4）碱性氨基酸精氨酸

Arginine赖氨酸

Lysine氨基酸的结构

天冬氨酸

Aspartate酸性氨基酸（5）酸性氨基酸及其酰胺氨基酸的结构

天冬氨酸Aspartate谷氨酸

Glutamate酸性氨基酸（5）酸性氨基酸及其酰胺氨基酸的结构

天冬酰胺Asparagine

含酰胺氨基酸（5）酸性氨基酸及其酰胺氨基酸的结构

天冬酰胺Asparagine谷氨酰胺

Glutamine

含酰胺氨基酸（5）酸性氨基酸及其酰胺氨基酸的结构

2、芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine氨基酸的结构

芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine氨基酸的结构

芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine色氨酸Trytophan氨基酸的结构

碱性氨基酸组氨酸

Histidine3、杂环氨基酸氨基酸的结构

脯氨酸

Proline（β-吡咯烷基-α-羧酸）

亚氨基酸组氨酸

Histidine3、杂环氨基酸氨基酸的结构

芳香族氨基酸组氨酸

Histidine脯氨酸

Proline色氨酸Trytophan3、杂环氨基酸甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）缬氨酸（Val,V）亮氨酸（Lue,L）异亮氨酸（Ile,I）中性脂肪族氨基酸含羟基或硫脂肪族氨基酸丝氨酸（Ser,S）苏氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺（Gln,Q）碱性氨基酸

赖氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）组氨酸（His,H）杂环芳香族氨基酸

苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trp,W）杂环氨基酸

组氨酸（His,H）脯氨酸（Pro,P）

20种氨基酸的名称及缩写代号几种重要的不常见氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。(二)氨基酸的分类

据营养学分类

必需ＡＡ非必需ＡＡ据R基团化学结构分类

脂肪族ＡA（中性、含羟基或硫、酸性、碱性）芳香族ＡA(Phe、Tyr，Trp)杂环ＡＡ(His、Pro、Trp)据R基团极性分类极性R基团AA非极性R基团AA（9种）不带电荷（6种）带电荷：正电荷（３种）负电荷（２种）据氨基、羧基数分类一氨基一羧基ＡＡ一氨基二羧基ＡＡ(Glu、Asp)二氨基一羧基ＡＡ(Lys、His、Arg)

人的必需氨基酸LysTrpPheValMetLeuIleThr

Arg、His蛋白质基本结构单位：L－－氨基酸

－氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）除外

L－氨基酸：甘氨酸（无不对称C）除外氨基酸结构通式：RCH(NH2)COOH

常见氨基酸种类：20种。小结2、氨基酸分类：按其侧链®的结构和理化性质分类①非极性、疏水氨基酸(非极性R基氨基酸)：Ala,Val,Leu,Ile（支链）；Gly（无旋光异构）；Met（含硫）；Phe,Trp（芳香族）；Pro（亚氨基）②极性氨基酸(不带电荷的极性R基氨基酸)：Ser,Thr（含羟基）；Tyr（芳香族）；Cys（含巯基）；Gln,Asn（含酰胺）③酸性氨基酸（含有两个羧基）：Glu（含γ羧基）、Asp（含β羧基）④碱性氨基酸（含有两个以上氨基）：Arg（胍基）、His（咪唑基）、Lys（ε氨基）含硫氨基酸：Met、Cys芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp据R基团化学结构分类

脂肪族ＡA（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）芳香族ＡA(Phe、Tyr，Trp)杂环ＡＡ(His、Pro、Trp)据R基团极性分类极性R基团AA非极性R基团AA（9种）不带电荷（6种）带电荷：正电荷（３种）负电荷（２种）(三)氨基酸的性质

1一般物理性质2两性解离和等电点3重要化学反应

与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）:用于蛋白质N-端测定.

与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应（Edman反应）：用于蛋白N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。

与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定

与甲醛反应：测定蛋白质的水解速度

1.一般物理性质

常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。

(2)熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200℃以上。(3)味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。0240250260270280290300310光密度TrpTyrPhe氨基酸的紫外吸收

芳香族氨基酸的紫外吸收大多数蛋白质均含有Tyr、Trp和Phe残基，因其结构上含有共轭双键苯环，在280nm处有最大吸收峰。利用紫外分光光度法，可测定蛋白质含量。2氨基酸的解离性质和等电点氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。PH1710净电荷+10-1正离子两性离子负离子

等电点PI氨基酸的等电点（isoelectricpoint,pI）

当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。

带电状态判定

pH>pI…………….带负电

pH＝pI…………….不带电

pH<pI…………….带正电

等电点计算①侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI=½(pK1+pK2)同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。②酸性氨基酸(Glu、Asp)及Cys：pI=½(pK1+pK2)③碱性氨基酸(赖、精、组)：pI=½(pK2+pK3)3,氨基酸的化学性质1(1)与茚三酮反应-氨基和羧基共同参与的反应茚三酮水合茚三酮

氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。★★★水合茚三酮在弱酸中与α-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，变成醛,最后，水合茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮反应，生成蓝紫色物质。（λmax=570nm）

茚三酮反应--显色反应例外：Pro黄色

反应特点A.为α-NH2的反应B.在常温，中性条件，甲醛与α-NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。应用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法（间接滴定）A.与甲醛反应，NaOH滴定,终点在9左右，可用酚酞作指示剂。B.释放一个氢离子，相当于一个游离氨基（摩尔比1：1）C.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。(2)与甲醛反应3.与2,4一二硝基氟苯(DNFB)反应

（sanger反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黄色)++HF弱碱中氨基酸

反应特点A.为α-NH2的反应B.氨基酸α-NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸

★首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构A.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽B.酸水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸C.分离DNP-氨基酸D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目4.与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应

（Edman反应）PITC（phenylisothiocyanate）+苯硫乙内酰脲衍生物(PTH-AA)

（phenylisothiohydantion-AA）弱碱中(400C)(硝基甲烷400C)H+PTC-AAEdman（异硫氰酸苯酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。由Edman于1950年首先提出为α-NH2的反应用于N末端分析，又称Edman降解法PITC反应

肽链（N端氨基酸）与PITC反应，生成PTC-肽环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸分离PTH-氨基酸层析法鉴定用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链灵敏度提高，能连续测定。多肽顺序自动分析仪样品最低用量可在5pmolEdman降解法的改进方法DNS-Edman降解法用DNS(二甲氨基萘磺酰氯)测定N端氨基酸原理DNFB法相同但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍可用于微量氨基酸的定量

（5）与荧光胺的反应

α-NH2的反应氨基酸定量（6）与5,5’-双硫基-双(2-硝基苯甲酸)反应-SH的反应测定细胞游离-SH的含量（7）其他反应成盐、成酯、成肽、脱羧反应氨基酸的性质

两性解离和等电点重要化学反应

与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）:用于蛋白质N-端测定.

与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应（Edman反应）：用于蛋白N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。

与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定

与甲醛反应：测定蛋白质的水解速度氨基酸的应用1，医药工业

氨基酸输液

必需氨基酸：苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸半必需氨基酸：精氨酸、组氨酸是幼儿所必需的。治疗药剂1，精氨酸：对治疗高氨血症、肝机能障碍等疾病颇有效果；2，天冬氨酸：钾镁盐可用于恢复疲劳；治疗低钾症心脏病、肝病、糖尿病等。3，半胱氨酸：能促进毛发的生长，可用于治疗秃发症；甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等；组氨酸：可扩张血管，降低血压，用于心绞痛，心功能不全等疾病的治疗。2，化学工业维生素B6:可采用丙氨酸或天冬氨酸为原料合成。叶酸：需要用谷氨酸为原料合成。氨基酸表面活性剂：酰基谷氨酸钠、十六烷基-L-赖氨酰-L-赖氨酸甲酯二盐酸、月桂酰-L-精氨酸乙酯盐酸等具有较强的抗菌杀菌活性，且无刺激性。聚合氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作为合成皮革的表面处理剂；聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯与磷酸高级烷基酯结合得到化合物可作为可塑剂，稳定剂等。3，食品工业营养强化剂；谷氨酸钠－味精；天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清凉感并使香味浓厚爽口；天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：－甜味素APM4，农业杀虫剂：刀豆氨酸、5-羟色氨酸可使南方毛虫拒食而死；半胱氨酸可杀死黄瓜蝇；甘氨酸乙酯衍生的二硫代磷酸盐具有较强的杀蚜虫和杀螨效果；杀菌剂：N-月桂酰缬氨酸可作为治疗稻瘟病；-1，4环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等；除草剂：如N-3,4二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等；5，化妆品工业氨基酸能调节皮肤pH的变动，对细菌的防护作用，也可作为皮肤、毛发的营养成分，增加皮肤、毛发的光泽。防止皮肤干燥的自然保湿因子的主要成分是甘氨酸、羟基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等游离氨基酸。在化妆品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些维生素，可防止皮肤老化。四多肽1、连接方式：肽键肽键(peptidebond)：一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基脱水而成的酰胺键称为肽键。（…CONH…）肽平面(peptideunit)：由肽键中的四个原子和与之相邻的两个碳原子共同构成的刚性平面。（CαCONHCα）2、肽分类、命名

肽的命名：按参与的AA残基：N端起××酰××酰…××酸按其功能：如:催产素（9肽）、抗利尿激素（9肽）按其来源：胰岛素；环状短杆菌肽按来源加功能：胰高血糖素（23肽）书写方式三字母缩写：HAla•cys•val•OH一字母缩写：HA•C•V•OH中文第一个字：H丙•半•缬•OH完全方式：如：牛催产素+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键四肽的结构3、生物活性肽：谷胱甘肽神经肽：脑啡肽、内啡肽、强啡肽、P物质、Y肽肽类激素：催产素、加压素等其他：生长因子；短杆菌S；甜味肽等谷胱甘肽（GSH）

全称：γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基可氧化、还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。

γ-羧基肽键肽键谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。抗菌肽

L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val

L-Orn

L-Orn

L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu

短杆菌肽S(环十肽)细菌分泌的多肽，含有D-Phe和鸟氨酸（Ornithine,缩写为Orn）。

合成部位：下丘脑化学本质：三肽（见下页图）生理功能：

a.促进腺垂体分泌促甲状腺素，后者促进甲状腺细胞增生、合成并分泌甲状腺激素b.可促进生乳素、催产素和降压素的分泌c.可影响大脑的机能，如抗抑郁、改变睡眠觉醒和行为促甲状腺素释放激素(TRH)α-促黑素(α-MSH）分泌：腺垂体

本质：13肽生理功能：

能促进皮肤黑色素的合成在两栖类和某些鱼类还可使黑色素细胞内聚集的黑色素分散布满细胞及其突起，使皮肤变深。

神经肽：在神经传导过程中起信号转导作用的肽类。

脑啡肽、-内啡肽、强啡肽、孤啡肽神经肽Met-脑啡肽

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-

Leu-脑啡肽

＋H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-氨基酸的等电点（isoelectricpoint,pI）

当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。

带电状态判定

pH>pI…………….带负电

pH＝pI…………….不带电

pH<pI…………….带正电

等电点计算①侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI=½(pK1+pK2)同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。②酸性氨基酸(Glu、Asp)及Cys：pI=½(pK1+pK2)③碱性氨基酸(赖、精、组)：pI=½(pK2+pK3)氨基酸的性质

重要化学反应

与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）:用于蛋白质N-端测定.

与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应（Edman反应）：用于蛋白N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。

与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定

与甲醛反应：测定蛋白质的水解速度五、蛋白质的结构蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。示例虾红素木瓜蛋白酶组织蛋白酶蛋白质结构

的主要层次一级结构四级结构二级结构三级结构primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequaternarystructure超二级结构结构域

supersecondarystructureStructuredomain（一）、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primarystructure)包括组成蛋白质的多肽链数目.多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。一级结构体现生物信息：20n………….多样一级结构是空间结构及生物活性的基础…..特异一级结构的连接键：肽键（主要）、二硫键在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln肽键、肽氨基酸残基蛋白质一级结构一级结构的连接键蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。

一级结构测定

基本战略：片段重叠法＋氨基酸顺序直测法将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序

将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定二硫键拆开纯蛋白质蛋白质顺序测定基本方法路线

测定步骤(1)，多肽链的拆分，测定多肽链数目。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。蛋白质一级结构的测定测定步骤多肽链的拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).蛋白质一级结构的测定测定步骤测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。蛋白质一级结构的测定测定步骤(2)，二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。蛋白质一级结构的测定胰岛素

-巯基乙醇碘乙酸二硫键的断裂(3)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；蛋白质一级结构的测定测定步骤(4)分析多肽链的N-末端和C-末端蛋白质一级结构的测定多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端基氨基酸测定多肽N、C-末端氨基酸的测定

N端Sanger法（二硝基氟苯反应）

DNS法（丹磺酰氯反应）Edman法（异硫氰酸苯脂反应）氨肽酶法C端肼解法还原法羧肽酶法Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。末端基氨基酸测定二硝基氟苯（DNFB）法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。末端基氨基酸测定丹磺酰氯法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。末端基氨基酸测定

氨肽酶法羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。末端基氨基酸测定羧肽酶法测定步骤(5)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。蛋白质一级结构的测定多肽链的部分裂解

酶解法：如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶化学法：如溴化氰法

羟胺法消化道内几种蛋白酶的专一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）2，测定步骤(6)测定每个肽段的氨基酸顺序。蛋白质一级结构的测定Edman（异硫氰酸苯酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。Edman氨基酸顺序分析法一般测定步骤(7)确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。蛋白质一级结构的测定片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意

所得资料：

氨基末端残基H羧基末端残基S第一套肽段第二套肽段

OUS

SEO

PS

WTOU

EOVE

VERL

RLA

APS

HOWT

HO借助重叠肽确定肽段次序：

末端残基HS末端肽段HOWT

APS第一套肽段HOWT

OUS

EOVE

RLA

PS第二套肽段HO

WTOU

SEO

VERL

APS

推断全顺序HOWTOUSEOVERLAPS一般测定步骤(8)确定原多肽链中二硫键的位置蛋白质一级结构的测定蛋白质测序的一般步骤

（1）拆分蛋白质分子中的多肽链，测定多肽链数目。

（2）测定多肽链的氨基酸组成。

（3）断裂链内二硫键。

（4）分析多肽链的N末端和C末端。

（5）多肽链部分裂解成肽段。

（6）测定各个肽段的氨基酸顺序

（7）确定肽段在多肽链中的顺序。

（8）确定多肽链中二硫键的位置。

蛋白质（纯）

测定分子量，估计AA残基数（除120）氨基酸自动分析仪测定AA数量、种类和比例肽链拆开次级键：用8mol/L脲或6mol/L盐酸胍二硫键：过甲酸；巯基乙醇；1，4－二硫代苏糖醇肽链末端分析N端：二硝基氟苯;丹磺酰氯法C端：肼解法；羧肽酶法肽链选择性裂解化学法：溴化氰裂解；羟胺法酶解法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶等肽段分离凝胶过滤离子交换层析氨基酸顺序分析：Edman法（异硫氰酸苯降解法）；酶解法多肽链中氨基酸序列分析的主要步骤（二）蛋白质的空间结构蛋白质的构象（conformation）：指蛋白质分子中所有原子的三维空间排列分布和肽链的走向。肽键肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。肽键肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。酰胺平面与α-碳原子的二面角（φ和ψ）

二面角

两相邻酰胺平面之间，能以共同的Cα为定点而旋转，绕Cα-N键旋转的角度称φ角，绕C-Cα键旋转的角度称ψ角。φ和ψ称作二面角，亦称构象角。完全伸展的多肽主链构象α-碳原子酰胺平面Φ=1800，ψ=1800Φ=00，ψ=00的多肽主链构象酰胺平面Φ=00，ψ=00侧链非键合原子接触半径蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链主链的折叠及盘绕方式。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有-螺旋、-折叠、-转角。1．蛋白质的二级结构（1）-螺旋

-helix在-螺旋中肽平面的键长和键角一定；肽键的原子排列呈反式构型；相邻的肽平面构成两面角；

①主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋；②螺旋每上升一圈是3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm,两个氨基酸之间的距离为0.15nm;③相邻螺旋圈之间形成链内氢键,氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的-NH基与前面第四个氨基酸残基的-CO基形成氢键。氨基酸残基侧链伸向外侧。（1）-螺旋-螺旋影响α-螺旋形成的因素主要是：①存在侧链基团较大的氨基酸残基；②连续存在带相同电荷的氨基酸残基；③存在脯氨酸残基。

（2）-折叠其结构特征为：①若干条肽链或肽段平行或反平行排列成片；②所有肽键的C=O和N—H形成链间氢键；③侧链基团分别交替位于片层的上、下方。

-pleatedsheet-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。-折叠卷发(烫发)的生物化学基础永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemicalengineering),—角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为—构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。这是因为—角蛋白的侧链R基一般都比较大，不适于处在—构象状态，此外—角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(—螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。（3）-转角

-turn多肽链180°回折部分，通常由四个氨基酸残基构成，借1、4残基之间形成氢键维系。

这类结构主要存在于球状蛋白分子中。肽链主链出现的180°回折部分称β-转角。（4）无

规

则

卷

曲无规则卷曲细胞色素C的二级结构2、超二级结构、结构域超二级结构(supersecondarystructure)（1）在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。（2）类型：αα、ββ、αβα、锌指结构、亮氨酸拉链★超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域．超二级结构类型βββααβ×β12345

52341

Β-链βαββ-迂回回形拓扑结构回形拓扑结构β-迂回螺旋区-回折-螺旋识别特定的DNA碱基序列

COOHNH2识别螺旋锌指（ZineFinger）基元Zn2+PheHisHisArgCysCysLeu锌指基元中Cys和His残基构成结合锌的位点锌指与DNA的作用DNA锌指EF手图象(钙调蛋白的钙结合位点的螺旋区-泡区-螺旋区结构)

Ca2+EhelixFhelixEF

①主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋；②螺旋每上升一圈是3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm,两个氨基酸之间的距离为0.15nm;③相邻螺旋圈之间形成链内氢键,氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的-NH基与前面第四个氨基酸残基的-CO基形成氢键。氨基酸残基侧链伸向外侧。（1）-螺旋（2）-折叠其结构特征为：①若干条肽链或肽段平行或反平行排列成片；②所有肽键的C=O和N—H形成链间氢键；③侧链基团分别交替位于片层的上、下方。

-pleatedsheet结构域

(structuredomain)

结构域:在二级结构及超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，是相对独立的紧密球状实体。多肽链折叠的最后一步是结构域间的缔合。

现在,结构域的概念有三种不同而又相互联系的涵义:即独立的结构单位、独立的功能单位和独立的折叠单位。

类型：

α-螺旋域；β-折叠域；α+β域；α/β域；无规则卷曲+β-回折域；无规则卷曲+α-螺旋结构域

结构域运动：结构域本身都是紧密装配的，结构域之间通过松散的肽键形成牢固而又柔韧的连接，为域间较大幅度的相对运动提供了可能，这种结构调整与其整体功能的行使密切相关。α/β结构域

丙酮酸激酶结构域4木瓜蛋白酶结构域1无规则卷曲+α-螺旋结构域无规则卷曲+β-回折结构域乳酸脱氢酶结构域1α+β结构域3-P-甘油醛脱氢酶结构域2木瓜蛋白酶结构域23．蛋白质的三级结构三级结构（tertiarystructure）：整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定空间结构。

或者说，三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。

维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。α-螺旋β-折叠β-转角无规则卷曲空穴

特征：含多种二级结构单元；有明显的折叠层次；是紧密的球状或椭球状实体；分子表面有一空穴(活性部位)；疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面。实例：肌红蛋白，核糖核酸酶

Mb和Hb的辅基—血红素血红素(heme)氧合肌红蛋白中血红素Fe2+的六个配体d2sp3核糖核酸酶三级结构示意图

N

His12CHis119Lys41寡聚蛋白中亚基的立体排布及相互作用。

亚基(subunit)：亚基是指参与构成蛋白质四级结构的而又具有独立三级结构的多肽链，单独存在时一般无生物学活性。亚基之间以非共价键联系，亚基可以相同或不同。亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、氢键、范德华力亚基可以相同或不同4、蛋白质四级结构四级结构中相同单体亚基的几种可能对称排列

假设的单体C2对称C3对称C4对称D2对称D3对称四级结构中相同单体亚基的几种可能对称排列（续前）

T对称八面体对称螺旋对称二十面体对称二十面体对称腺病毒两个亚基的结构血红蛋白是脊椎动物红细胞主要组成部分，它的主要功能是运输氧和二氧化碳。血红蛋白中，血红素Fe原子的第六配价键可以与不同的分子结合：无氧存在时，与水结合，生成去氧血红蛋白(Hb)；有氧存在时，能够与氧结合形成氧合血红蛋白(HbO2)。血红蛋白与氧的结合不牢固，容易离解。HbO2的形成和离解受氧的分压和pH等因素的影响，氧的分压和pH较高时，有利于血红蛋白与氧的结合，反之，则有利于离解。

血红蛋白血红素在蛋白中的位置血红蛋白的四级结构得测定由佩鲁茨1958年完成，其结构要点为：球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基两条α链，两条β链，α2β2α链：141个残基；β链：146个残基分子量65000含四个血红素辅基亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团在分子内部煤气中毒的机制一氧化碳（CO）也能与血红素Fe原子结合。由于CO与血红蛋白结合的能力是O2的200倍，因此，人体吸入少量的CO即可完全抑制血红蛋白与O2的结合，从而造成缺氧死亡。急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的CO被O2置换出来。

（三）．蛋白质分子中的共价键与次级键

一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→亚基→四级结构维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水作用、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：疏水作用、氢键、范德华力、盐键

a盐键（离子键）b氢键c疏水作用d范德华力e二硫键1)，氢键

氢键的形成氢键是由两个负电性原子对氢原子的静电引力所形成。它是质子给予体X-H和质子接受体Y之间的一种特殊类型的相互作用。氢键的大小和方向氢键的键能比共价键弱，比范德华力强，在生物体系中为8.4～33.4kj/mol(2-8kcal/mol)。键长为0.25～0.31nm，比共价键短。氢键的方向用键角表示，是指X—H与H…Y之间的夹角，一般为180～250。2)离子键

正电荷与负电荷之间的静电相互作用生物大分子表面的带电基团可以与底物分子的带电基团形成离子键。这种键可以解离。3).范德华力

这是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力。它是一种比较弱的、非特异性的作用力。这种作用力非常依赖原子间的距离，当相互靠近到大约0.4～0.6nm(4～6A)时，这种力就表现出较大的集合性质。范德华力包括引力和排斥力，其中作用势能与1/R6成正比的三种作用力（静电力、诱导力和色散力）通称为范德华引力。4),疏水作用

蛋白质中的疏水残基避开水分子而聚集在分子内部的趋向力

高分子的蛋白质可形成分子内疏水链、疏水腔或疏水缝隙，可以稳定生物大分子的高级结构。

氢键、范德华力、疏水作用、离子键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水作用对维持三级结构特别重要离子键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定离子键氢键范德华力疏水作用六蛋白质的分子结构与功能的关系

一级结构决定高级结构，也决定蛋白质的功能高级构象决定蛋白质的功能（一）一级结构决定高级结构，

也决定蛋白质的功能1、蛋白质一级结构的种属差异与同源性

实例：细胞色素Ｃ2、蛋白质一级结构的变异与分子病

实例：血红蛋白质异常病变镰刀型贫血病3、蛋白质前体的激活与一级结构

实例：酶原的激活不同生物与人的Cytc的AA差异数目生物与人不同的AA数目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、猪、羊、狗11马12鸡、火鸡13响尾蛇14海龟15金枪鱼21角饺23小蝇25蛾31小麦35粗早链孢霉43酵母44

不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基

14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血红素细胞色素c分子的空间结构不变的AA残基35个不变的AA残基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。前体蛋白与活性蛋白的转变（切除冗余及其它变化）前体蛋白（一级结构冗余，高级结构错误，因此无生物活性）活性蛋白（具有正确的一级结构和高级结构，因此具有生物活性）适合环境【经典举例】酶原激活：胃蛋白酶原切除N端42个氨基酸后形成活性中心及其他空间构象，转变为具水解蛋白质活性的胃蛋白酶；胰蛋白酶原切除N端6个氨基酸后形成活性中心及其他正确构象，转变为具有水解活性的胰蛋白酶。（二）高级构象决定蛋白质的功能

1、蛋白质高级构象破坏，功能丧失

实例：核糖核酸酶的变性与复性2、蛋白质在表现生物功能时，构象发生一定变化（变构效应）

实例：血红蛋白的变构效应和输氧功能核糖核酸酶变性与复性作用NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis变性复性蛋白质的构象与功能的关系别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象.它是细胞内最简单的调节方式.例：血红蛋白的别构效应一个亚基与氧结合后，引起该亚基构象改变进而引起另三个亚基的构象改变整个分子构象改变与氧的结合能力增加O2HbHb-

O2O2血红蛋白输氧功能和构象变化朊病毒(prion,virino)疯牛病(海绵状脑病)一种感染性蛋白粒子致病因子称朊病毒PrPsc为致病型蛋白粒子PrPsc在神经细胞内沉积细胞破裂组织出现无数空洞状如筛子称为海绵状脑病七蛋白质的重要性质

（一）、蛋白质的相对分子质量（二）、两性解离性质及等电点（三）、蛋白质胶体性质（四）、蛋白质的沉淀（五）、蛋白质的变性与复性（六）、蛋白质呈色反应（一）.蛋白质的相对分子质量蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于10000.最高可达40000000（烟草花叶病毒）．

超速离心凝胶过滤聚丙烯酰胺凝胶电泳1.超速离心利用物质密度的不同，Pr经超速离心后，分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定Pr的分子量，Pr的分子量与其沉降系数S成正比。用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关

离心机结构示意图转头转头腔沉降样品驱动马达真空冷冻沉降系数

（sedimentationcoefficient）

生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。

沉降系数单位：由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介于1×10-13秒到200×10-13秒的范围，为方便起见，把作为沉降系数的一个单位，用Svedberg单位，用即S表示。沉降系数（s）与相对分子量（Mr）的关系:Mr=RTsD(1-)Svedberg方程:2.凝胶过滤法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：SephadexGel-FiltrationChromatography–Separationbasedonsize3.PolyacrylamideGelElectrophoresis(PAGE)MoleculesareseparatedbysizeinanelectricfieldSmallermoleculesmigratemorerapidlythroughporousgelmatrixSilverstainedPAGEgelSlabgelProteinsaredetectedinPAGEgelsbystainingorautoradiography

(二)蛋白质两性解离性质和等电点

蛋白质两性解离性质和等电点

pH=pI

净电荷=0pH<pI净电荷为正pH>pI净电荷为负PrCOOHNH3++H++OH-+H++OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+蛋白质的性质蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。蛋白质的两性离解和电泳现象电泳蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。结构域:

在二级结构及超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，是相对独立的紧密球状实体。三级结构（tertiarystructure）：整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定空间结构。α-螺旋β-折叠β-转角无规则卷曲空穴

特征：含多种二级结构单元；有明显的折叠层次；是紧密的球状或椭球状实体；分子表面有一空穴(活性部位)；疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面。指亚基的相互关系，空间排布，亚基间通过非共价键聚合而成的构象。

亚基(subunit)：亚基是指参与构成蛋白质四级结构的而又具有独立三级结构的多肽链，单独存在时一般无生物学活性。亚基之间以非共价键联系，亚基可以相同或不同。蛋白质四级结构维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水作用、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：疏水作用、氢键、范德华力、盐键

a盐键（离子键）b氢键c疏水作用d范德华力e二硫键由于蛋白质的分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。

（三）蛋白质的胶体性质++++++++--------++++++++--------蛋白质胶体颗粒的沉淀

带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质酸酸碱碱脱水脱水脱水不稳定的蛋白质颗粒（沉淀）带正电荷的蛋白质（疏水胶体）带负电荷的蛋白质（疏水胶体）碱酸（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）蛋白质胶体性质的应用

透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。

盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（saltingout）。透析工作图半透膜原理蛋白质在溶液中维持稳定的因素：

表面电荷、水化层（溶剂化层）

如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。（四）蛋白质的沉淀作用

沉淀方法类别:1、高浓度中性盐（盐析）2、酸碱（等电点沉淀）3、有机溶剂沉淀4、重金属盐类沉淀5、生物碱试剂和某些酸类沉淀6、加热变性沉淀变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性试剂：丙酮、乙醇、甲醇等亲水溶剂能与水以任意比例混合，有脱水作用。原理：①脱水作用；②↓水的介电常数和蛋白质溶解度。应用：pI沉淀Pr。调节溶液pH到某Pr的pI，加上丙酮破坏水化膜，Pr沉淀。注意：防止Pr在分离过程中发生变性：①0－4℃下进行；②有机溶剂浓度不能太高，Pr沉淀后立即分离有机溶剂沉淀法：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。（四）蛋白质的沉淀作用可逆沉淀在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。（四）蛋白质的沉淀作用不可逆沉淀蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。变性不涉及一级结构的变化。（五）蛋白质的变性蛋白质的变性变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。

表征：生物活性丧失；物理性质（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性等）和化学性质（化学反应，被酶解性）改变蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程。变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为复性（renaturation）。应用①利用变性：酒精消毒高压灭菌血虑液制备②防止变性：低温保存生物制品③取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒)沉降系数,单位蛋白质等电点,指定pH条件下蛋白质电泳方向蛋白质胶体稳定因素,透析蛋白质沉淀方法,盐析蛋白质变性(六)蛋白质主要呈色反应

双缩脲反应米伦氏反应酚试剂反应→蛋白质定量、定性测定乙醛酸反应坂口反应

1.双缩脲反应：

双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成红紫色的复合物含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应肽键的反应，肽键越多颜色越深受蛋白质特异性影响小蛋白质定量测定双缩脲反应

蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物红紫色络合物(碱性溶液)Cu2+

2.米伦氏反应酪氨酸的显色反应（酚基反应）米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色3.乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成色氨酸的反应（吲哚环的反应）鉴定蛋白质中是否含有色氨酸明胶中不含色氨酸4.坂口反应精氨酸的反应（胍基的反应）精氨酸与α-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物鉴定蛋白质中是否含有精氨酸定量测定精氨酸5.福林试剂反应酪氨酸的反应（还原反应）福林试剂：磷钼酸-磷钨酸产生蓝色产物

与双缩脲法结合Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍6.茚三酮反应灵敏度差7.黄蛋白反应浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应生成黄色化合物指甲、皮肤、毛发8.考马斯亮蓝G-250本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高11000微克/毫升盛有2

mL鸡蛋白溶液的试管里，滴入几滴浓硝酸，颜色变黄。

双缩脲反应米伦氏反应酚试剂反应→蛋白质定量、定性测定乙醛酸反应坂口反应

反应试剂颜色反应基团有此反应的Pr及AA双缩脲反应

NaOH,CuSO4

红紫色

2个以上肽键所有蛋白质Millon反应

硝酸(汞)，亚硝酸(汞)红色酚基TyrFolin酚试剂反应

磷钨酸-钼酸

兰色

酚基Tyr乙醛酸反应乙醛酸H2SO4

紫红吲哚Trp坂口反应

次氯酸钠,萘酚红色

胍基Arg茚三酮反应

茚三酮

紫兰色

游离氨、羧基Pro和羟Pro呈黄色（六）、蛋白质的呈色反应黄色反应

HNO3及NH3

黄、橘黄苯基Phe,Tyr八蛋白质的分类根据分子形状分类球状蛋白质纤维状蛋白质结合蛋白质根据组成分类简单蛋白质活性蛋白质（如酶蛋白、转运蛋白、运动蛋白、保护和防御蛋白、受体蛋白…...）根据功能分类非活性蛋白质（如硬蛋白、角蛋白）1依据蛋白质的外形分类按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。球状蛋白质：globularprotein外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质：fibrousprotein分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。2依据蛋白质的组成分类按照蛋白质的组成，可以分为简单蛋白(simpleprotein)和结合蛋白(conjugatedprotein)。简单蛋白