基因工程-2课件

基因工程技术1第三章基因工程的常用载体2主要内容载体的功能及特征质粒（plasmid）λ噬菌体M13噬菌体考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体3作为运载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）高效率的进入宿主细胞3）具多个单一限制酶切点，以便与外源基因连接。4）具有较高的外源DNA的载装能力。5）具有某些标记基因，便于进行筛选。6）容易从宿主细胞分离出来，便于后续体外操作5质粒是细菌或细胞染色体外，小型共价闭合环状双链DNA(cccDNA)分子，是能够独立复制并保持恒定遗传的复制子。与宿主共存的遗传单位。

（二）质粒1、质粒的定义6细胞内独立的能够自我增殖的结构单位为复制子；包括与复制控制有关的结构和与复制控制无关的结构；细菌的染色体是一个复制子，而真核生物染色体是多个复制子的复合体。72、质粒的种类Col质粒

：大肠杆菌素因子。产生大肠杆菌素。F质粒

：致育因子，可借此与其他细菌接触，传递质粒DNA。R质粒：抗药因子，可控制细菌产生灭活药物的酶，或降低细胞膜对药物的通透性，可对某些抗生素产生抗性。已成为耐药性基因之源。

9ColE1质粒小分子量多拷贝不能自动转移编码蛋白质性质的大肠杆菌素10F-质粒大分子量低拷贝（1-2）可自动转移11R质粒接合或非接合转移性质粒；复制基因和转移基因位于R-因子的一处，耐药基因位于另一处。RTF区(耐药性转移因子)带有转移基因.R决定区带有耐药性基因（常是转座子的成分）13抗药性包括：氯霉素（Cm），氨苄（Ap）氯霉素（Cm）；卡那（Km）；链霉素（Sm）对金属离子抗性砷（As3+），汞（Hg2+），镍（Ni2+）银（Ag+）14（1）自主复制性是能独立复制的复制子。质粒DNA复制的质粒可随宿主的分裂传给下一代。

3、质粒的基本特征15（3）不相容性

任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。

17

两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，在复制和分配到子细胞时存在竞争，致使两种质粒的最终拷贝数不同。质粒的不相容性：分子机制1819革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如含F因子质粒等；

非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用；目前在基因工程实验室中常用的质粒属于此类。（4）可转移性21质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，常见性状包括：抗生素抗性（如抗四环素、Amp、Kan）重金属离子抗性基因、复杂有机物的分解基因

。它们通常是宿主细胞生长所非需的。颜色反应（如蓝白筛选）（5）携带特殊的遗传标记2223滚环式复制：单向复制，从ori开始，结束于ori254、质粒改造构建天然质粒往往存在不同程度的缺陷，因而不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建：

（1）具有复制起始点具有复制子的功能，且起始区域没有所需的酶切位点。（2）加入合适的选择标记基因如两个以上，易于用作选择。（3）增加或减少合适的酶切位点，便于重组

266、实验室常用质粒优点：1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。2、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。pBR32229特点：1）分子量小，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝）。2）抗性和蓝白筛选,易于检测。3）多克隆位点区（MCS）.pUC系列30β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。

蓝白筛选原理31lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（β链）互补，产生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZα-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。32β—半乳糖苷酶基因的优点:a.

酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观b.lacZα编码5‘-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性c.lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大33pUC衍生载体T7和SP6启动子可进行体外转录34由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同寄主细胞中进行存活和复制的质粒载体。大肠杆菌-酵母，大肠杆菌-枯草芽孢杆菌

穿梭质粒35T7promoter：T7特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等。原核表达载体367、质粒DNA的分离纯化最常用的方法为碱裂解法原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

用此方法制备的质粒较纯，收得率高，但繁琐，且质粒中有开环现象。

37用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNA38沸水浴法

（1）将菌体悬浮在含有EDTA和TritonX-100的缓冲液中

（2）加溶菌酶破细胞壁

（3）放入沸水浴中煮40秒

（4）离心，用无菌牙签挑去沉淀物

（5）乙醇异丙醇沉淀

此法制备的质粒不纯，收得率低，且制备规模小，但快速，特别适用于重组质粒的鉴定。39图1图2超螺旋>环状>线状40质粒大小应以线性状态做判断6kb12345671、2、3、5：单一酶切位点4：两个酶切位点7：未酶切质粒41

分子量，拷贝数多为内切酶提供切点的机会小容易提取8、质粒载体的优缺点优点

克隆片段小，小于10kb缺点42噬菌体是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来。

（二）λ噬菌体1、噬菌体介绍43温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体．（双链ＤＮＡ）烈性噬菌体：只有溶菌生长周期的噬菌体．44λ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体λ噬菌体由外壳包装蛋白和λ-DNA组成λ-DNA全长48502个核苷酸λ-DNA上至少有61个基因（必要，非必要基因）2、λ噬菌体生物结构45线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端），称为cos区。463、λ噬菌体感染周期

47噬菌体的包装

484、λ噬菌体的溶原状态

λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态。DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态。

491）缩短长度2）删除多余的酶切位点3）加装选择标记4）构建琥珀型密码子突变体5、λ-DNA载体的构建策略50野生型λ-DNA包装的上限为51kb（包装范围36-51kb），本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。

1）缩短长度51野生型λ-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。被切除后，不影响生命功能。根据切除的多少，可将λ-DNA分成两大类载体：

插入型载体

取代型载体52插入型载体由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。λDNA中缺失部分非必要基因，只含有一个供外源基因插入的酶切位点的λDNA载体。53取代型载体*36-51kb为包装的上下限

λDNA的可替换片段两端具有两个酶切位点，酶切后替换片段与带有所有必需基因的左右两臂分开，由外源DNA片段取代。542）删除重复的酶切口

野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个。为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。553）加装选择标记

与质粒不同，野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容。λ-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：

免疫功能类标记颜色反应类标记56

加装选择标记imm434（免疫功能插入失活）

imm434基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，λ-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。这种形态学上的差异，为分离重组体提供了方便的标志。57插入失活：外源DNA克隆到插入型λ载体上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。58lacZ（β-半乳糖苷酶插入失活）lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能降解X-gal，不能合成蓝色化合物，形成无色空斑；而空载体λ-DNA则产生蓝色透明斑。594）构建琥珀型密码子突变体

琥珀型突变（sup)

：是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。将野生型λ-DNA上两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种λ-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散。基因工程实验中用的菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。

60

λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。用于体外包装的蛋白质可直接从感染了λ噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。6、λ-DNA重组分子的体外包装61这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少头部的E组份，另一部分则缺少头部的D组份。

包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组λ-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组λ-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。62λgt系列载体λgt10、λgt11和λgt18-23等，适合cDNA的克隆（约6kb）7、常用的λ噬菌体载体λgt10：imm434阻遏基因（免疫功能插入失活）根据噬菌斑的浑浊与否判断是否插入外源片段。λgt11：与lacZ融合表达的表达载体，用抗体探针检测融合蛋白，筛选重组子。63λEMBL系列载体

克隆大片段基因组DNA的替换型载体，克隆容量可达20kb，用于基因组文库构建。648、λ-DNA及其重组分子的分离纯化1.大肠杆菌培养至对数生长期2.加入λ-噬菌体悬浮液，37℃培养1小时3.用新鲜培养液稀释，继续培养4-12小时4.高速离心，沉淀噬菌体5.酚抽提，释放λ-DNA6.乙醇或异丙醇沉淀DNA659、λ-DNA作为载体的优点：λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量重组λ-DNA分子的筛选较为方便重组λ-DNA分子的提取较为简便λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因66λ-DNA载体的装载量最大为25kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，柯斯质粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。柯斯质粒(cossite-carryingplasmid)就是含有λ-DNA两端cos区和质粒复制子的杂种质粒载体。

（三）柯斯质粒1、柯斯质粒的定义67

由于λ-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端（cos）附近的一小段顺序，均1.7kb长，通过特异切割体系，将多联体分子切割，然后进行包装。2、构建柯斯质粒载体的思路68将噬菌体DNA中与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建柯斯质粒载体的思路。69与λ噬菌体DNA不同的是：柯斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞。相同的是：可体外包装，具有感染性。与质粒相同的是：柯斯质粒具有质粒的复制子，能象质粒一样在宿主体内进行复制。。它的制备与质粒相同。不同的是兼有噬菌体的某些性质。70

3、柯斯质粒的优越性（1）具有噬菌体的某些特性能象λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞，由于柯斯质粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。71（2）具有质粒载体的特性携带质粒的选择标记，便于筛选。具有质粒的复制子，能象质粒一样在宿主体内进行复制；具有质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。

72可以装载比质粒或λ-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7kb，质粒长为3.3kb，则该考斯质粒最大可装载47kb的外源DNA。（3）装载量大73外形：丝状噬菌体；单链环状（6.4kb）DNA分子；DNA为正链DNA（感染性单链）；感染带有F性纤毛的 E.coli菌株或转染雌性菌株；复制以双链环形（RFDNA）作媒介单双链都可转染宿主

（四）M13噬菌体载体1、M13的结构特征7475ori7677人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时柯斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。

（五）人工染色体载体78将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区(自主复制序列，ARS)、分配区(着丝粒序列，CEN)、稳定区（端粒序列，TEL）与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。79目前常用的人造染色体载体包括：

细菌人工染色体（BAC）装载量范围在50-300kb之间。

酵母人工染色体（YAC）YAC载体的装载量为350–400kb。8081分两类：不带真核复制子的质粒型载体

在原核质粒中插入一个完整的哺乳动物细胞转录单位和一个选择标记基因而组成的简单载体系统。转染前在细菌中扩增