双周周四-文献翻译

锚蛋白重复序列传导力 机械力转导通道打WeiZhang,LiE.Cheng,MaikeKitmann,JiefuLi,MajaPetkovic,TongCheng,PengJin,ZhenhaoGuo,MartinC.Göpfert,LilyYehJan,YuhNungJan时感受器电位（TRP）的NOMPC通道是一种作用于果蝇触觉听觉感知的假说，认为这些锚蛋白重复序列作为将力传导至通道的系绳。本文中，我们N末端的锚蛋白重复序列形成了一个胞质域，其对于体外NOMPC机械力锚蛋白重复序列将延长将机械力敏感性神经元中NOMPC牵引到微管上的丝。除此之外，微管的连接对于NOMPC的机械力门控是必需的。重要的是，所得嵌合体通道同样呈现出机械力敏感性。这些实验有力地支持了NOMPC通在将力传导至通道““过程中共同总用。已有大量支持细菌MscL通道和真核生物钾离子通道的膜力模型，然而系绳模型的直接分子少之又少。TRP通道中，NOMPCARNOMPC作用于幼虫运动中至关重要。NOMPC基本满足真正机械力转导通道的所有条件，究。NOMPCAR在机械力转导过程中作为系绳的可这项研究中，我们测试带有不同AR删除或的NOMPC突变体，发现29AR的完整性对于体外表达系统及体内触觉受体神经元中的NOMPC机械门控NOMPC机械敏感性至关重要。为测定Kv1.2Kv2.1中，使用超过去极化可达到NOMPCNOMPCNAR的作用，我们首先评估了其相对于细胞膜的NOMPC蛋白不同区域的抗体对细胞进行通透性表位抗体(αNOMPC-EC;图1A)，该抗体可在非通透条件下识别质膜中的(αNOMPC-N-ter1A)C端的抗体(αNOMPC-C-ter1A)均在通透处理TRP通道。锚蛋白重复序列对于NOMPC膜表达 通道亚基预测结构的拓扑学简图。洋红标记表明本使用抗体被识别的位使用孔螺旋（αNOMPC-EC）、NOMPCN末端（αNOMPC-N-ter）和NOMPCC（αNOMPC-C-ter）NOMPC蛋白进行非通透处理的染色（比例尺，10μm）(C)对NOMPC蛋白进行通透处理染色(D–K)分子结构简图，表面染色（比例尺，5μm）ARNOMPC0mV（灰色和-60mV（黑色时进行电流（比例尺，10pA）右边的条形图呈现表明NOMPC染色的荧光强度（F.intensity）（相对强度，n=2810101125121729。在不同倍数全长和Δ1-12AR-NOMPC之间进行配对t检验，∗∗∗p<0.001）。全长NOMPC删除29个AR的NOMPC13-29ARNOMPC16-29ARNOMPC删除1-12AR的NOMPC将前12个AR与后17两倍AR重复的NOMPC17ARNOMPC膜定位正常所有误差线表示±标准误也可见图S1，图S2和ARNOMPC使用识别NOMPC胞外域的抗体（αNOMPC-EC）对细胞膜上的NOMPC17ARΔ1-12AR的表现类似于N14-18AR的低温敏TRPA11217ARARΔ13-29AR含有前12个AR)测试AR的两个区域是否存在差异。当后17个ARΔ13-29AR-NOMPC)的表面表达量和开放概率(1H,S2A,andS2B)12AR17个NOMPC蛋白折叠，组装或膜定位是必需的。此外，只有显示表面表达的突变体和野生型(WT)NOMPC蛋白显示自发通道活动(图ARNOMPCNOMPCAR介导了机械力转导通道的门控。为检验该理论的NOMPC(29+29AR-NOMPC)显示机械门控(2Aand2B)。尽管对膜片区域上NOMPC介导的电流ARNOMPC介导的更大(2C,红条)，然而根据表面表达水平进行与野生型NOMPC处于同一水平(图2C,黑条)。相比之下，即使突变体Δ1-12AR-NOMPC29+17AR-NOMPC蛋白都有表面表达和自发通道活动，用同一压力使膜变形并不能引起其应答(图2A–2C)。自发通道活动可能来自物Gd3+阻断(图S2C)AR的完整性对于NOMPC通道的机械力转导是（B）机械门控性电流振幅（绝对值）图（n=12,11,8,7。单因素方差分析后进行∗∗∗p12,11,8,7Tukey∗∗∗p<0.001）(EF)应答压力（E）(n107)及压电位移（F）(n10687)NOMPC机械门控性电S2细胞并在全细胞结构下记录应答时，可得到类似结果(2D)。这些机械性门控电流振幅取决于机械力刺激的强度(2Eand2F)。特别地，当不存在机械刺激时，Δ1-12AR-NOMPCNOMPC更有可能开放(图S2AandS2B)。因此，NOMPC29AR的结构完整性对机械门控至关重要，其可能通过形成一个螺旋的全幅转弯进行力转导。对NOMPC门控的ARNOMPC果蝇幼虫体壁第三类多树突（da）神经元感受温和触觉，依赖于NOMPC的机械力转导。nompC无效突变使神经元不再产生触碰激发的应答。为研究NOMPCAR在这些机械力感受神经元中所起作用，我们检测由第三类多树突神Gal4激活蛋白（19-12-Gal4）ARNOMPC通道29+29AR- 均能被运往树突的质膜。然而，第三类多树突神经元中现象在异源细胞中也被发现1J)移动体壁20μm象(图3Band3C)。第三类多树突神经元中野生型NOMPCAR重复(29+29AR)NOMPC的表达能恢复突变表型的触觉激发应答，而29+17AR,Δ1-29AR,或Δ1-12AR的NOMPC则不行3Band3C)29+29AR的的部分修复可能与较低的表达水平相关S3AandS3B)。结合图二体外实验29ARNOMPC通道在体内机械力感受功能体内NOMPC通道功能依赖锚野生型和NOMPC突变体在nompC无效突变体中第三类多树突神经元的表达（比例尺，第三类多树突神经元对机械力刺激的应答，揭示全长NOMPC和29+29AR- nompC空白表型的功能恢复，而其他突变的NOMPC通道ompC无效突变体幼虫缺失的触觉应答可通过表达全长NOMPC或2+2AR-NOMPC得以恢复，而通过第三类多树突神经元特异性Gl4（1912-Gl4在第三类多树突神经元中激活其他突变NOMPC通道则不表现这种作用。我们使用非成对t检验进行两组间比较，并进行单因素方差分析及Tkey比较以分析3或4组数据。s,无显著差异。∗∗p<.01,p<.0.所有误差线表示标准误。型如下：w1118nompCnompC1/nompC3.(全长NOMPC):nompC1/nompC3;19-12-Gal4,UAS-NOMPC-GFP.Δ1-29AR:nompC1/nompC3;19-12-Gal4/UAS-Δ1-29AR-NOMPC-GFP.Δ1-12AR:nompC1/nompC3;19-12-Gal4/UAS-Δ1-12AR-NOMPC-GFP.29+17AR:nompC1/nompC3;19-12-Gal4,UAS-29+17AR-NOMPC-GFP.NOMPC-介导的幼虫触觉依 的表达，可恢复其触觉敏感性(3D)Δ1-29AR,Δ1-12AR,或29+17AR的NOMPC通道则不行。AR是膜-状连接，即膜-微管连接器（MMCs）MMCNOMPCAR则排列可使用电子显微镜辨别出4A)，基于对其良好的解剖基础，我们使用实定位于野生型果蝇（”NOMPC+“），nompC1-无效4A–4CandS4)NOMPC29+29AR-NOMPCMMCs明显增长（MMC平均长度±标准差：18±5nm[NOMPC29+29AR]，15±5nm154nm[NOMPC29+29AR],124nm[NOMPC+])(4D).AR是膜-微管连接器的重平衡棒钟形感受器树突状尖端的总体结构（比例尺果蝇平衡棒钟形机械力受体机械敏感性树突状尖端的横截面，描绘了细胞外鞘、细胞膜、微管和膜-微管连接器（MMCs，箭头）。MMCs在NOMPC+野生型果蝇（左图）中呈现，但在ompC1无效突变体（NOMP-,中图）中不再呈现。经由NOMPC-GAL4在无效突变体中表达2+2AR-NOMPC，恢复MMC（NOMP2929A右图（比例尺，20nmMMCs特写（上），MMC临摹图（底）。对于每一种压力，呈现小（左）和大（右）微管-膜间距离的样本（比例尺，20nm。红线突MMC的结构）。MMCs相连接的微管片段计算而得的NOMPC+NOMPC-,NOMPC29+29AR果MMC的相对丰度。NOMPC29+29ARMMCNOMPC+果蝇中类似(p0.05)，而NOMPCNOMPC果蝇中丰度存在显著差异(p0.001,Bonferroni校正Mann-WhitneyU-检验；分析的钟形受体数量:31(NOMPC+),24(NOMPC-),41+)--的膜-∗∗∗显著差异p0.001,使用BonferroniMann-WhitneyU-检验如此超结构效应；据，NOMPC蛋白的丢失很大程度上并不会改变微管-膜间距离，暗示MMC调整张力以适应预设的距离。然而，当我们系统分析NOMPCNOMPC果蝇膜-nompC无效[NOMPC−]，124nm[NOMPC+])(4D)MMC似乎将膜与微管拉29+29AR-NOMPC的果蝇中，微管-NOMPC+和NOMPC−果蝇(图4D)中发现的显著不同，介于二者之间。NOMPC据，异源表达NOMPC蛋白质在培养细胞中也与微管相连。NOMPC表面附近区域尤为明显(图5A)。使用NOMPC抗体(αNOMPC-EC)对非通透性NOMPC通道于微管共定位(5B)。道与膜附近皮层微管相互作用的概念相一致(图5CandS5A)。S2细胞中NOMPC表达不能改变微管分布(S5B)NOMPC蛋白是否与微管结微管强烈相互作用(图5D)，说明NOMPC通道可能与细胞中的微管相结合。图5NOMPC通道与微管的连接对于机械门控至关重要面附近0.35μm中心平面。NOMPCS2NOMPC和微管进行染色（比例尺，5μm）。取盖片表面附近0.35μm中心平面。TIRF显微镜显示细胞皮层区域的膜NOMPC和微管间相互作用（比例尺，1μm）NOMPC形成细胞裂解液或微管蛋白亲和层析纯化物的共沉淀测定 有微管蛋白−MT,无微管蛋白S,上层清液P,颗粒诺考达唑对NOMPC机械门控电流阻碍的时程（0-150s间的配对t检验，p0.001,n=6）。,t检验n6and6)。膜片保持电压+60mV50mmHg负压。向生理盐水中加入诺考达唑(100nMn7)或秋水仙胺(10μMn6)，该电压降低，加入紫杉醇(10nMn6)却不变（比例尺，50pA.∗∗∗p0.001N.S.:统计不显著，配对t检验）(I)+60mV下NOMPC的机械门控电流达到50mmHg负压，向生理盐水中加入细胞松弛素D(10nM,n=6)、微丝解聚素A(1μM,n=6)或jaskinolide(100nM,n=7)均无影响（比例尺，50pA.N.S.,统计不显著，配对t检验）。鉴于近期涉及TRPV1通道与微管在渗透诱导的细胞收缩过程中的相互NOMPC机械门控中必需。在内面向外膜片中，向对机械力刺激的应答电流大大降低(图5E)。在细胞吸附模式中诺考达唑同样有相似效应(5Fand5G)NOMPCNOMPC在质膜中的表达水平没有影响(图S5DandS5E)NOMPCKv1.2Kv2.1通道电压门控无影响(S5F–S5I)。化学成分NOMPC通道门控有类似的效应，NOMPC活动无影响(5H)，进一步说明微管对NOMPC机械门控至关重要。相比之下，稳定或破坏肌动蛋白细胞骨架对NOMPCKvARARNOMPC转移至其他离子通道是否依然能体现机TRP29AR(M1-S1268fromNOMPC)NOMPCN-末端胞浆域和Kv1.2跨膜（TM）C末端(G160-V499fromKv1.2)，构建嵌合蛋白(S1268-G160-Kv1.2chimera)(6A)。为检测此嵌合体通道是否有机械力刺激门控能力，我们对从经转染的S2细胞中获得的外面向外膜片施加Cs+则不能触发(6Band6C)NOMPCS1前的连接体对机械力转导非常重要，因为不含该连接体(M1-M1120fromNOMPC)，而NOMPCARKv1.2C末端(G160-V499fromKv1.2)的嵌合体通道(M1120-G160-Kv1.2chimera)不具有机械敏感性(图6Band6C)。为确证机械敏感性电流实际上来源于S1268-G160-Kv1.2嵌合体，我们检测了特定Kv1.2通道阻遏剂蝎毒素（MTX），这是一种能阻遏嵌合体通道的机械敏感性电流的毒素(6D)NOMPC的通道活动并无影响(S6AandS6B)。NOMPC锚蛋白重复序列将机械敏感性赋予KvNOMPCKv1.2Kv2.1构建嵌合通道的策略。用黑点强调界定蛋白质片段边界嵌合体通道S126-G160Kv.2对负压导致的膜变形显示机械门控电流，而Cs+溶液中不存在这种现象（灰色轨迹）。而全长Kv1.2（WTKv.2），N末端截短的Kv.(Kv1.ΔNtrmins)和M112-G16-Kv1.2嵌合体均对同一刺激无应答。外面向外膜片保持电压0mV。机械门控电流振幅图(n2681077.单因素方差分析后进行Tukey∗∗∗p机械门控电流被蝎毒（MTX）部分阻挡（∗∗∗p0.001,t检验n对负压引起膜变形显示机械门控电流，而全长Kv2.1(WTKv2.1)、N末端截短的60mV。Kv1.2没有表现出机械敏感性(6Band6C)，但的跨膜区域和C末端，构建嵌合通道(图6A)，而据Kv2.1不具有机械敏感性。嵌合通道(S1268-V182-Kv2.1chimera)AR-Kv1.2嵌合通道类似的机械敏感性，而野生型Kv2.1、缺少N-末端胞浆域的Kv2.1(Kv2.1ΔNterminus)和不含连接体而包含NOMPCAR、Kv2.1TM域和C末端的嵌合通道(M1120-G182-Kv2.1chimera)没有机械敏感性(6Eand6F)。NOMPC振幅(2E7BandS7B)。S1268-G160-Kv1.2嵌合通道产生的机械敏感性电流在持续压力刺激的应答上呈现出适应现象(图7C)。机械敏感性嵌合通道的生物物当施加压力增大时（压力在10mmHg-50mmHg范围内每次增加10mmHg），AR-Kv1.2 的机械门控电流对于压力的剂量依赖性曲线AR-Kv1.2嵌合通道产生的机械门控电流表现对持续刺激的适应。膜片持续压强60mVKv1.2通道、AR-Kv1.2嵌合通道与微管共标记（比例尺，5μm；方框强调微(FG)Kv1.2（F）AR-Kv1.2嵌合通道（G）的代表性(H)野生型Kv1.2和AR-Kv1.2嵌合通道在存在或不存在机械刺况下的I-V曲线，100mV下标准化至没有机械刺激的电流（灰色虚线强调V1/2处的电流-电压关系）。膜片保持-80mVn4))(K)WTKv2.1AR-Kv2.1嵌合通道在有或无机械刺激下I-V100mV下标准化至没有机械刺激的电流（灰色虚线强调V1/2处的电流-电压关系。膜片保持电压-80mV(WTKv2.1n=4，嵌合通道n=5)。所有误差线表示±标准误。又见图嵌合通道表现出微管的相互作用，这与NOMPC通道类似，且比野生型Kv通道更显著(图7EandS7C)。用诺考达唑破坏微管后将大大消除嵌合通道的机械力应答(7D)，而对于野生型Kv1.2通道则没有影响(S5FandS5G)AR-Kv1.2嵌合通道产生的机械门控电流同样依赖于微管的完整性。这些实验为AR电流，Kv1.2(图7F–7H)和Kv2.1(7I–7K)经过标准化后的电流(I/Imax)电压相关性均被左移。通过在每个膜去极化步骤中向AR-Kv嵌合通道的膜片施加50mmHg压力脉冲，我们对处于接近去极化终点附近平台期的电流，及去极化I-V曲线，Kv1.27H)Kv2.1(7K)12.1mV28mV，而对于野AR的转移也赋予了含有电压感受器和Kv1.2或Kv2.1的孔道的嵌合通道机械ARNOMPCMMC的成我们的分析记录了NOMPCAR将延长MMC，这支持之前关于AR是不足以加倍其长度。由于测定仅限于二维平面，而的锚蛋白可能更为紧密，电子显微镜不能解决这种情况，则长度增