常用免疫测定方法的原理和质量

常用免疫测定方法的原理和质量第1页，共94页，2023年，2月20日，星期四非标记免疫分析：补体结合试验，免疫速率散射比浊测定标记免疫分析：放射免疫法、酶标记免疫法、荧光免疫法、发光免疫法、电化学发光免疫定量免疫免疫分析中的质量问题

1、工具抗体

2、包被（反应载体及其抗原或抗体的包被）

3、标记物

4、校准

5、基质效应第2页，共94页，2023年，2月20日，星期四从定性试验到定量测定第3页，共94页，2023年，2月20日，星期四补体结合试验，曾经最敏感抗原-抗体反应形成的免疫复合物能结合补体，红细胞及其抗体能指示补体的含量，由此较敏感地推断抗原或抗体的含量主要特点：现已少用，红细胞不易保存和标准化第4页，共94页，2023年，2月20日，星期四免疫速率散射比浊测定即测定最大反应速率，在抗体过量的情况下，反应峰值的高低与抗原的量成正比。峰值（最大导数）出现的时间与抗体的浓度及其亲和力直接相关。利用不同抗原含量与其速率峰值的函数关系，计算出抗原含量主要特点：不必等到抗原抗体达到平衡，可节省反应时间，检测敏感度量为mg/L水平,生化仪上可做透射比浊测定，抗体必须过量且为R型第5页，共94页，2023年，2月20日，星期四第6页，共94页，2023年，2月20日，星期四标记免疫分析放射免疫法（同位素碘125标记）：免疫放射测定法，放射免疫测定法酶标记免疫法（标记酶分子量比碘125大，空间位阻大，标记酶容易失活）荧光免疫法：时间分辨荧光免疫分析，酶标记荧光免疫测定，荧光偏振免疫测定，Luminex技术发光免疫法电化学发光免疫

第7页，共94页，2023年，2月20日，星期四放射免疫法（同位素碘125标记）免疫放射测定法（immunoradiometricassay，IRMA）：夹心法，系用放射性同位素标记抗体（*Ab）主要特点：灵敏度较高，被测物需有两个以上抗原决定簇放射免疫测定法（radioimmunoassay，RIA）：竞争法，系利用放射性同位素标记抗原，主要特点：被测物低浓度时的精度较差，受到抗体量的限制第8页，共94页，2023年，2月20日，星期四RosalynYalow(1977获诺贝尔奖）第9页，共94页，2023年，2月20日，星期四标记免疫的发展第10页，共94页，2023年，2月20日，星期四酶标记免疫法

显色底物法（比如酶联免疫吸附试验，ELISA）：主要采用辣根过氧化物酶标记和碱性磷酸酶标记，主要特点：大多数采用的96孔酶标板，测单孔成本低，新项目上得快，但容积小，孔间包被差异大，特别是偶尔出现的“坏包被孔”导致双孔测定的高成本等荧光底物法：采用碱性磷酸酶标记，以磷酸伞型酮作为底物，主要特点：属于酶免疫，其效果取决于采用反应的载体，自动分析能克服酶标的一些缺点发光底物法

第11页，共94页，2023年，2月20日，星期四酶标记免疫法：发光底物法

采用碱性磷酸酶标记，以金刚烷衍生物的磷酸盐为底物，它在碱性磷酸酶(ALP)作用下,磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基,开始裂解并发光，可持续几十分钟。主要特点：属于酶免疫，但发光时间长，效果取决于采用反应的载体，自动分析能克服酶标的一些缺点第12页，共94页，2023年，2月20日，星期四酶（标记）化学发光免疫分析第13页，共94页，2023年，2月20日，星期四荧光（fluorescence）发射光的能量来自激发光的能量即激发一停，发光立即停止，余辉≤10-8s(0.01μs)者荧光基本不受温度影响第14页，共94页，2023年，2月20日，星期四磷光（phosphorescence

）发射光的能量也来自激发光激发光停止后，发光还会延续一段时间，即余辉≥10-8s(0.01μs)又分为短期磷光(余辉10-8s~10-4s)和长期磷光(余辉≥10-4s)磷光的衰减强烈的受温度影响时间分辨荧光免疫分析中作为标记物的稀土离子(如Eu3+、Tb3+、Sm3+和Dy3+)产生的“长寿命荧光”实际就是长期磷光(可长达数十、数百、乃至数千μs)第15页，共94页，2023年，2月20日，星期四化学发光(chemiluminescence)发射光的能量来自发光物的化学(氧化还原)反应，简称“发光”生命物质的化学发光称为生物发光发光是常见的自然现象，人们最熟悉的发光生物是萤火虫，在海深2000米以下，多数生物都发光第16页，共94页，2023年，2月20日，星期四第17页，共94页，2023年，2月20日，星期四荧光免疫法

时间分辨荧光免疫分析酶标记荧光免疫测定，同上节酶标记免疫法中的荧光底物法荧光偏振免疫测定Luminex技术：将流式细胞术中的概念创造性地用于高效率平行测定血清成分，是上个世纪末实验室检测技术中最重要的发明之一第18页，共94页，2023年，2月20日，星期四时间分辨荧光免疫分析timeresolvedfluoroimmunoassay;TRFIA

以镧系元素作为标记物所建立的免疫测定技术主要特点：因镧系元素(如Eu3+)所发射的荧光寿命长，在测定特异性荧光时，可通过延迟检测时间而将标本或环境中的非特异荧光扣除，使其具有良好信噪比第19页，共94页，2023年，2月20日，星期四时间分辨荧光免疫分析第20页，共94页，2023年，2月20日，星期四荧光偏振免疫测定fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光(525nm)。偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关主要特点：最适宜检测小至中等分子物质，常用于药物、激素的测定第21页，共94页，2023年，2月20日，星期四荧光偏振免疫分析第22页，共94页，2023年，2月20日，星期四发光免疫法发光分子标记（化学发光免疫分析，CLIA）：用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的是吖啶酯,它能直接与过氧化氢反应而发光。主要特点：化学反应简单、快速、无须催化剂，吖啶酯分子量小，位阻小；检测小分子抗原采用竞争法,大分子抗原则采用夹心法,非特异性结合少,本底低;与大分子的结合不会减小所产生的光量,从而保证了灵敏度酶标记发光免疫测定：同上节酶标记免疫法中的发光底物法。电化学发光免疫第23页，共94页，2023年，2月20日，星期四化学发光免疫分析第24页，共94页，2023年，2月20日，星期四电化学发光免疫electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA用三联吡啶钌衍生物，即[Ru(bpy)3]2+N羟基琥珀酰胺酯，作为标记物，利用其与三丙胺在电化学池内进行氧化还原反应而发光主要特点：发光反应的能量由电极补充，发射光的线性范围大，从而保证了较大的测定范围，但是电化学池内进行反应会影响速度，且需防止携带污染（冲洗）第25页，共94页，2023年，2月20日，星期四工作电极(阳极)上一定的电压能量作用下，二价三联吡啶钌释放电子发生氧化反应而成为三价的三联吡啶钌，同时，电极表面的三丙胺（TPA）也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基TPA+

，并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基TPA·这样，在反应体系中就存在强氧化性的三价三氯联吡啶钌Ru(bpy)33+

和强还原性的三丙胺自由基TPA·后两者发生氧化还原反应，结果使三价的三联吡啶钌还原成激发态的二价Ru(bpy)32+，并以620nm波长光子释放能量后回到基态，再进入下一个循环第26页，共94页，2023年，2月20日，星期四定量免疫分析中的质量问题

工具抗体包被（反应载体及其抗原或抗体的包被）标记物校准基质效应第27页，共94页，2023年，2月20日，星期四工具抗体

多克隆抗血清（来自许多细胞株，不同类、不同型，不同亲和力，针对抗原的不同表位）单克隆抗体（来自统一细胞株，一模一样，针对抗原的表位）混合单克隆抗体的优点处和局限性多克隆抗血清与混合单克隆抗体结合使用面对的问题：被测分子表位的变异亚型，亲和力和滴度，抗体的来源和不同的表位特异性第28页，共94页，2023年，2月20日，星期四包被（coating)载体：

96孔酶标板的问题单珠和微球的区别磁微粒（球）包被物状态干燥悬浮液第29页，共94页，2023年，2月20日，星期四标记物标记物大小：

碘-125D

吖啶酯-481D

碱性磷酸酶-68000D(IgG-150000D)冻干液相标记分子结合物（conjugate）第30页，共94页，2023年，2月20日，星期四校准(caliberation)校准品:

赋值，复溶，降解校准(caliberation)和拟合(normalization)

线性反应的校准非线性反应的拟合免疫试剂测定曲线的校准

第31页，共94页，2023年，2月20日，星期四校准品的赋值校准品与仪器和试剂共同组成一个不可分割的系统校准品的值是由参考系统传递的这种传递的媒介是新鲜的病人样品（比如血清、血浆或者全血）校准品赋值的目标是为了让本系统测定的病人结果更接近参考系统测定的结果“为了病人结果准确，校准品可以牺牲自己”第32页，共94页，2023年，2月20日，星期四校准(caliberation)校准品:

赋值，复溶，降解校准(caliberation)和拟合(normalization)

线性反应的校准非线性反应的拟合免疫试剂测定曲线的校准

第33页，共94页，2023年，2月20日，星期四校准(caliberation)第34页，共94页，2023年，2月20日，星期四拟合(normalization)第35页，共94页，2023年，2月20日，星期四基质效应基质的差异在定量分析中的影响：什么是“基质（matrix)”？样本基质差异能避免吗？关于一致化的问题：

harmonization（和谐）可替代性第36页，共94页，2023年，2月20日，星期四定量免疫分析的质控方法新世纪是否存在实验室质量问题？临床质量管理的历史实验室的质量控制方法6西格玛质量管理质量管理中的几个问题第37页，共94页，2023年，2月20日，星期四新世纪是否存在实验室质量问题？生产厂商不断发展着分析系统许多实验室认为分析质量已不成为问题或甚至不是实验室的责任其实不然!让我们看一下这两年涉及免疫的全国室间质量评价吧!第38页，共94页，2023年，2月20日，星期四2000年第一次内分泌室间质量评价总结

甲状腺素(T4):CV%(均值/中位数/最大/最小)1#103.18%(4.71/3.95/40.3/0.46)2#98.98%(8.76/7.42/74.3/0.85)3#112.18%(15.68/13.10/154.4/1.20)4#108.44%(4.74/4.00/44.0/0.46)5#96.8%(8.76/7.50/71.2/0.82)第39页，共94页，2023年，2月20日，星期四2001年第二次内分泌室间质量评价总结(除外3s)促甲状腺激素(TSH):CV%(均值/中位数/最大/最小)E21:91.38%(2.90/2.38/16.80/0.05)E22:155.70%(1.58/1.03/16.80/0.03)E23:219.46%(1.85/0.80/23.88/0.04)E24:193.99%(1.83/0.88/17.6/0.01)E25:182.30%(1.13/0.71/14.50/0.02)第40页，共94页，2023年，2月20日，星期四2002年第二次内分泌室间质量评价总结(除外3s)化学发光的结果促甲状腺激素(TSH):CV%(均值/中位数/最大/最小)E21:19.69%(2.44/2.38/3.47/1.44)E22:18.58%(1.13/1.07/1.51/0.56)E23:19.05%(0.84/0.81/1.16/0.37)E24:19.15%(0.94/0.89/1.31/0.46)E25:19.47%(0.76/0.72/1.03/0.34)第41页，共94页，2023年，2月20日，星期四2003年第一次内分泌室间质量评价总结中催乳素(PRL):

(除外3s)各种方法的结果方法(N)CV%(均值/中位数/最大/最小),E11#所有方法(152):32.86%(525/505/1356/100)放射免疫(14):42.33%(630/572/1356/309)化学发光(88):25.73%(475/499/814/117)微粒酶免(18):21.65%(678/670/884/421)电化发光(21):27.25%(570/489/898/407)时间分辨(6):129.77%(932/403/3380/32)第42页，共94页，2023年，2月20日，星期四2003年第二次内分泌室间质量评价总结中催乳素(PRL):

(除外3s)各种方法的结果方法(N)CV%(均值/中位数/最大/最小),E21#所有方法(146):33.67%(1326/1283/3791/458)放射免疫(15):60.71%(1842/1426/4242/458)化学发光(85):20.65%(1209/1247/1950/660)微粒酶免(13):21.79%(1816/1723/2635/1131)电化发光(24):21.16%(1296/1232/1856/802)时间分辨(3):***%(***/***/878/611)第43页，共94页，2023年，2月20日，星期四2002年第二次内分泌室间质量评价总结中催乳素(PRL):

(除外3s)各种方法的结果方法(N)CV%(均值/中位数/最大/最小),E21#所有方法(86):43.42%(5.29/4.86/1577/21)放射免疫(15):67.89%(973/748/2415/79)化学发光(47):18.57%(467/467/744/336)微粒酶免(13):32.65%(544/553/721/27)酶联免疫(2):***%(***/***/486/261)电化发光(5):26.38%(631/686/796/379)时间分辨(2):***%(***/***/666/367)第44页，共94页，2023年，2月20日，星期四QualityControlisnotsomethingtobeperformedwithoutthought.Thereisnosinglewayto"doQC",andthenotionthat2SDlimitsarethestandardQCpracticeisbothout-datedandwasteful.Dr.Westgard

质量控制并非不假思索便可成就，也没有独一无二的“做质控”方法，以为2SD界限就是标准质控的观念看来既过时又浪费。韦斯特伽德博士第45页，共94页，2023年，2月20日，星期四临床质量管理的历史40年代美国宾夕法尼亚州1967年美国通过“临床实验室改进法案”（CLIA67）1958年Freier等引入Levey-Jenning图，开始IQC1972年CAP开始EQA(PT)1988年美国通过“临床实验室改进修正案”（CLIA88）2000年ISO提出质量管理体系的概念第46页，共94页，2023年，2月20日，星期四实验室质量管理的历史发展过程

现场检查→质量控制（室内质控，室间评价…）→质量保证（CLIA67和CLIA88中的QC和QA的规定）→质量改进→质量（管理）体系（按ISO9000进行质量认证和按ISO17025进行实验室认可）→全面质量管理第47页，共94页，2023年，2月20日，星期四

第48页，共94页，2023年，2月20日，星期四第49页，共94页，2023年，2月20日，星期四临床实验室QC模式的演进Levey-Jenning图和单一规则的应用Levey-Jenning图和Westgard多(判断)规则

6个主要规则:12s/13s/22s/R4s/41s/10xQC多规则流水线:12s起动13s/22s/R4s/41s/10xLevey-Jenning图和个性化设计的QC注重成本效益的QC根据实际条件和需要选择质控规则和所测质控物数目第50页，共94页，2023年，2月20日，星期四Levey-Jennings图直方图显示质控值期望的分布从质控数据计算平均值和标准差(s)以建立质控界限期望的质控值进入质控界限内:95%在2s内,99.7%在3s内将对应于时间的质控值点入提供了质控图确认非期望的质控值(失控点):12s警告,13s失控第51页，共94页，2023年，2月20日，星期四第52页，共94页，2023年，2月20日，星期四Westgard多规则QC6个主要规则:12s/13s/22s/R4s/41s/10x

QC多规则流水线:12s起动13s/22s/R4s/41s/10x第53页，共94页，2023年，2月20日，星期四第54页，共94页，2023年，2月20日，星期四第55页，共94页，2023年，2月20日，星期四第56页，共94页，2023年，2月20日，星期四第57页，共94页，2023年，2月20日，星期四第58页，共94页，2023年，2月20日，星期四第59页，共94页，2023年，2月20日，星期四第60页，共94页，2023年，2月20日，星期四第61页，共94页，2023年，2月20日，星期四个性化设计的QC注重成本效益的QC“选择规则”的质控:根据测定项目的不精密度、偏差和规定的总误差，以及期望的误差检出率(90%)和尽可能低的假报警(5%)，选用尽可能简单的规则,以体现成本效益。第62页，共94页，2023年，2月20日，星期四设定质量目标（确定分析项目的TEa）↓评价本实验室所用分析方法的不精密度（CV%）和不准确度(Bias)↓画出OPSpecs图↓评价误差检出概率(Ped)和假失控概率(Pfr)↓确定质控方法（包括质控规则和质控品测定的个数）↓重新评价性能第63页，共94页，2023年，2月20日，星期四QC能否保证测定方法可接受若没有定义质量要求，QC只能反映变化我们是通过定义“靶”值和允许总误差（TEa)以确定“质量要求”的通过所测定项目的偏差和CV能计算出总误差（TE),并与TEa进行比较，以此确定该方法是否能被接受统计小结同样用于评估新批号试剂、快速检查校准(calibrations)和评估均值漂移第64页，共94页，2023年，2月20日，星期四第65页，共94页，2023年，2月20日，星期四第66页，共94页，2023年，2月20日，星期四第67页，共94页，2023年，2月20日，星期四Weexpectonerunoutof20(5%)tofallbetween2and3SDfromthemean.第68页，共94页，2023年，2月20日，星期四Whenmostdatapointsfallwithin+/-1SD,theassignedSDismuchhigherthantheactualobservedvalue.第69页，共94页，2023年，2月20日，星期四AsignificantincreaseinrandomerrordoesnotgenerateaQCflagwhentheASSIGNEDSDissignificantlyhigherthentheACTUALvalue.第70页，共94页，2023年，2月20日，星期四第71页，共94页，2023年，2月20日，星期四第72页，共94页，2023年，2月20日，星期四

ThecalculatedmeanandSDareincorrectifthedataincludetwopopulationswithdifferentmeans.

第73页，共94页，2023年，2月20日，星期四第74页，共94页，2023年，2月20日，星期四ThecalculatedSDisincorrectifthedataincludetwopopulationswithdifferentSDs.第75页，共94页，2023年，2月20日，星期四第76页，共94页，2023年，2月20日，星期四6-Sigma

质量管理6-Sigma质量管理是美国临床实验室质量管理的几年前的又一潮流，进入较快的发展阶段。

6Sigma概念曾是摩托罗拉公司上世纪80年代质量管理策略的主要框架。这一想法发展了能够生产出那样优质（事实上是无缺陷）产品的制造过程第77页，共94页，2023年，2月20日，星期四第78页，共94页，2023年，2月20日，星期四第79页，共94页，2023年，2月20日，星期四

Cpk=(可接受规格

-bias)/3s

第80页，共94页，2023年，2月20日，星期四第81页，共94页，2023年，2月20日，星期四质控图的几点要求设定的靶值应当与实际的均值一致，不一致怎么办？设定的SD应当与实际的SD一致（或接近），不一致怎么办？方法精度越高，SD越小，如何避免因为过小的SD使临床完全能够接受的结果，因为质控超过3SD，而“被报废”？第82页，共94页，2023年，2月20日，星期四解决办法既然优秀的实验室可以做到6西格玛，即超出6SD才算不合格（超过允许总误差TEa）