中国药典2005年版无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容简介

2006年8月1主要内容1、无菌检查方法学验证关键点及常见问题2、微生物限度检查方法学验证关键点及常见问题3、细菌内毒素检查方法学验证关键点及常见问题第一页，共246页。2006年8月2无菌检查的方法学验证相关规定无菌检查验证的关键点验证中常见的问题第二页，共246页。2006年8月3

一、相关规定

药品无菌和微生物限度检查方法验证作为中国药典2005年版增订的一项重要内容对促进我国药品微生物检验的标准化是十分重要和必要的，执行近一年以来的情况表明，方法验证是促使我国药品无菌和微生物限度检查方法更加合理、科学和严谨的重要途径。（2006年6月全国会议纪要）第三页，共246页。2006年8月4

中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、研讨存在的问题，希望各级领导能给予高度重视，从各方面支持这项工作长期持续发展。实际工作中，药品生产、研发企业和各级药检所在工作中都存在很多困难和问题。第四页，共246页。2006年8月5关于执行《中国药典》2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明

国药典发[2005]98号

各药品检验所：

根据国食监注[2005]234号“关于颁布和执行《中国药典》2005年版有关事宜的通知”规定，《中国药典》7月1日起开始执行，各药品检验所在执行“微生物限度检查法”和“无菌检查法”过程中遇到了一些问题，为保证《中国药典》2005年版的顺利实施，现就有关问题说明如下：第五页，共246页。2006年8月6

1．“微生物限度检查”和“无菌检查”是药品安全性检查的重要项目。虽然近几版《中国药典》均收载有“微生物限度检查法”和“无菌检查法”，但在如何保证检验方法的科学性和检验结果的准确性方面与国外药典相比仍具有一定差距，其关键是《中国药典》未强调对检验方法进行必要的方法验证。为此，药典会设立专项科研课题，对2005年版《中国药典》的“微生物限度检查法”和“无菌检查法”增加验证试验的必要性进行研讨。根据研究结果，2005年版《中国药典》规定当进行药品的“微生物限度检查”或“无菌检查”时应进行方法验证。第六页，共246页。2006年8月7验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定方法及确定的检测系统是否适用于该供试品的检验，即只有通过方法验证，才能确定供试品的检验条件和方法，保证“微生物限度检查”或“无菌检查”方法的科学性和检验结果的准确性。第七页，共246页。2006年8月82．不同企业生产的相同品种，特别是中成药，因原料来源、工艺、辅料的不同，药品可能表现出不同的抑菌特性；同一个企业生产的相同品种，因原料来源不同、工艺改变或不同实验室等原因，也可能导致检测结果的差异。因此，不同企业生产的相同品种进行“微生物限度检查”或“无菌检查”时，其具体试验方法如冲洗量等不能简单照搬，需通过验证试验核实该试验方法和检测系统是否适宜。第八页，共246页。2006年8月93．目前各药检所涉及的检验工作可分为三类：注册检验（包括进口注册和新药注册）、监督抽验和进口检验。考虑到各检验性质的差异，各口岸所在进行进口复核及进口检验时，应请企业提供方法验证材料或详细的SOP资料进行审核；各口岸所完成复核时应在修订的进口注册标准中明确“微生物限度检查”或“无菌检查”的关键操作点（如供试品的处理方法等）及试验方法（如平皿法、薄膜过滤法、直接接种法等），并在复核说明中概述验证实验结果，以方便以后的进口检验。第九页，共246页。2006年8月10对国内新药的注册检验，也应请企业提供方法验证资料，如果企业提供不出方法学验证资料，根据药品注册管理办法，应在审核意见中明确指出“方法学未经验证，无法检验”，并建议企业重新建立“微生物限度检查”或“无菌检查”方法。监督抽验药品，由于2005年版以前历版《中国药典》未强调进行方法学验证，故各药检所目前在进行具体品种检验时难度较大，故也应请企业提供方法验证资料并进行审核，未经过方法学验证的“微生物限度检查”或“无菌检查”结果，决不能给出“符合2005年版《中国药典》的规定”的结论。第十页，共246页。2006年8月11

国家药典委员会

中国药品生物制品检定所

二00五年十月十一日第十一页，共246页。2006年8月12

●验证的目的:验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。

●验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。

第十二页，共246页。2006年8月13二、无菌检查验证的关键点验证的类型●前验证:建立药品的微生物限度检查法和无菌检查法时（当建立药品的无菌或微生物限度检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查）。●再验证:修订的检验方法;供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时;定期的方法验证（若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证）。第十三页，共246页。2006年8月14无菌检查验证用菌株：金黄色葡萄萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]**拟修订为大肠埃希菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Asperglllusniger)[CMCC(F)98003]第十四页，共246页。2006年8月15菌株选择的原则:代表性,普遍性,易存活、低或非致病性,标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。菌名分类芽孢对氧需求铜绿假单胞菌革兰氏阴性杆菌无芽孢需氧枯草芽孢杆菌革兰氏阳性杆菌有芽孢需氧金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌无芽孢需氧大肠埃希菌革兰氏阴性短杆菌无芽孢需氧生孢梭菌梭菌有芽孢厌氧第十五页，共246页。2006年8月16菌种的要求：传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。加菌量:＜100cfu。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每—试验菌应逐一进行验证。第十六页，共246页。2006年8月17菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18-24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，23～28℃培养24～48小时，上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu(菌落形成单位)的菌悬液。第十七页，共246页。2006年8月18

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用0.9％无菌氧化钠溶液制成每lml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。第十八页，共246页。2006年8月19验证方法：

直接接种法薄膜过滤法第十九页，共246页。2006年8月20薄膜过滤法

将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。按规定温度培养3～5天。各试验菌同法操作。第二十页，共246页。2006年8月21直接接种法

取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠茵、黑曲霉各2管。其中1管接人规定量的供试品，另1管作为对照，按规定的温度培养3～5天。第二十一页，共246页。2006年8月22结果判断：

与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。第二十二页，共246页。2006年8月23消除供试品抑菌的方法增加冲洗量增加培养基的用量使用中和剂或灭活剂：

β-内酰胺酶、对氨基苯甲酸更换滤膜品种注意：重新进行方法验证。第二十三页，共246页。2006年8月24方法学验证资料试验记录要点总的要求：详细、严谨、可操作性供试品信息检验数量和检验量：按照无菌检查的量确定供试品处理、供试品溶液的制备检验方法（选择直接接种法说明理由）实验用菌代数、稀释级、计数检验条件：主要是冲洗条件（冲洗液、冲洗次数、量，必要时说明滤膜材质、仪器、泵速等条件）。需要中和、酶处理等特殊处理方法的需说明逐日记录各菌的生长情况第二十四页，共246页。2006年8月25方法学验证资料试验结论采用的方法：薄膜过滤法/直接接种法关键实验点：如冲洗条件、中和、酶处理等因素第二十五页，共246页。2006年8月26三、验证及资料中常见的问题

薄膜过滤法加菌的时机不一致（供试品中和阳性对照中）按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，而验证试验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌的生长的影响，可以与对照滤器比较而作出判断，所以验证试验中加菌时机要与对照一致（中检所讲义）。第二十六页，共246页。2006年8月27薄膜过滤法滤膜材质选择不正确，直接影响试验结果普通滤膜有机膜低吸附滤膜1.根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。2.应保证滤膜在过滤前后的完整性。3.采用全封闭过滤器注意观察膜的状态，某些油性供试品或采用蓖麻油等作为溶媒的供试品可以损伤普通滤膜。第二十七页，共246页。2006年8月28

验证试验：按规定的温度培养3～5天无菌检查：阳性对照培养48～72h应生长良好

验证试验与无菌检查培养观察时间是不同的，不加区分影响对阳性菌生长缓慢的判断第二十八页，共246页。2006年8月29敏感菌株与阳性对照菌不一致，降低了阳性对照菌的意义阳性对照菌不是验证试验选定的敏感菌株实际工作中抑制枯草芽孢杆菌的样品很多（敏感菌株），但阳性对照只能选择金黄色葡萄球菌。第二十九页，共246页。2006年8月30关于大肠埃希菌的问题供试品无菌检查中规定“抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌”，但在方法学验证中所用菌株没有大肠埃希菌。解决措施：抗革兰阴性菌的抗菌药物进行方法学验证时增加大肠埃希菌。即将修订，将铜绿假单胞菌修订为大肠埃希菌。修订后按新方法执行。第三十页，共246页。2006年8月31薄膜过滤法和直接接种法如：一般供试品（无特殊说明），完全可以采用薄膜过滤法，而生产单位进行的无菌检查验证法为直接接种法。也有的厂家把两种方法的验证都写上，结论中也没有说明采用那种方法。CP2005：无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法，只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。修订：改为薄膜过滤法重新进行验证。方法选择错误，不符合CP2005版要求第三十一页，共246页。2006年8月32进行供试品无菌检查时，所采用的检验方法和检验条件应与验证的方法相同。结合无菌检查检验数量和检验量确定验证时取样量。如同时进行无菌检查一定要按照规定的检验数量和检验量取样。检验数量和检验量与验证试验的量不同，与CP2005版验证要求不符第三十二页，共246页。2006年8月33生产单位进行方法学验证时检验数量要按照表1批出厂产品最少检验数量。检验量（每只样品接入每种培养基的最少样品量）同上市抽验品种。无菌检查法中规定：只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。因此，验证试验中检验量就多不就少，如10ml注射液，虽然每个滤膜每容器取2ml也符合药典规定，10支分配至3个或更多滤筒也可，但建议取15支分3个滤筒（贵重药品和抗生素品种可灵活掌握，但不能低于最少量）。第三十三页，共246页。2006年8月34举例说明上市抽验样品无菌检查方法学验证检验量（液体制剂）≤1ml每个菌10支,共60支（全取样）1＜V＜5共30（取样量为半量）5≤V＜20建议30（取样量为2ml，建议全部过滤）20≤V＜50建议30（取样量为5ml，建议全部过滤）50≤V＜100建议30（取样量为10ml，建议全部过滤)50≤V＜100（静脉给药）共30（取样量为半量）100≤V≤500共18（取样量为半量）＞500第三十四页，共246页。2006年8月35对检验数量和检验量的把握应考虑便于实际操作，比如处理100ml/袋的样品，取9袋样品一次分配到一组三联滤器，检验数量大于药典规定的6个，但检验量似乎不符合药典规定的每袋样品取半量检验的规定，仅为1/3，但根据药典检验量即为一次试验所用供试品总量（g或ml）的解释，这与先将6袋分配两个滤筒，再将剩下3袋抽入一个滤筒作为样定对照的方法一样，却更节省时间。（中检所讲义）第三十五页，共246页。2006年8月36冲洗条件、冲洗量的选择太盲目有些厂家提供的验证资料中，对非抑菌性供试品也采用大量的冲洗，100ml/次*10次/膜，增加了出现误差的机会。1.对膜的损伤2.检验方法繁琐，大大增加检验人员的工作量（检验要按照已经验证的方法进行）3.验证试验方法选择总的原则是由易到难第三十六页，共246页。2006年8月37冲洗不一定为100ml/次，可少量多次，如50ml/次，注意充分振摇。对于抑菌性较强的供试品，可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤，以减少膜的吸附,减少冲洗量。如：抗生素品种取规定量，混合至含适量稀释液（如500ml等)的无菌容器中，然后再过滤。对于抑菌性较强的注射用无菌粉末或固体原料，一定要充分溶解、混合均匀。抗菌药可以根据其抗菌谱选择敏感菌先进行预试验，找到合适的条件再进行其他菌的实验。采用开放式薄膜过滤器：滤膜分成几份与取样量、冲洗条件的选择有关，建议尽量与无菌检查法一致（最常见为3等分）。第三十七页，共246页。2006年8月38方法描述不够详细，没有可操作性如某产品验证资料“将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入小于100CFU的试验菌，过滤。取出滤膜接种至……中，或将培养基加至滤筒中”。验证的目的是为了“照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查”，方法确立后，以后该产品就可以采用该方法进行检验。应记录取样量、（稀释方法）、冲洗液、冲洗量（冲洗条件）等。第三十八页，共246页。2006年8月39特殊情况眼用液体制剂：制剂通则中规定，眼用液体制剂微生物限度检查法为“除另有规定外，按薄膜过滤法或直接接种法检查，至少从2支供试品抽取规定量（每种培养基各接种2支，每支1ml），直接或处理后接种于硫乙醇流体培养基及改良马丁培养基中。培养7天，不得有菌生长。若有菌生长，应重新取2倍量供试品，分别依法复试，各管均不得有菌生长。”眼用液体制剂微生物限度检查的方法验证同无菌检查方法学验证。第三十九页，共246页。2006年8月40微生物限度检查的方法学验证概述微生物检查验证的关键点验证中常见的问题第四十页，共246页。2006年8月41一、概述微生物限度检查法验证的目的：确认所采用的方法是否适合于供试品的微生物限度检查。验证的内容：包括准确性(回收率)、专属性。验证的类型：前验证(建立微生物限度检查法时的验证)和再验证(修订检验方法后、供试品组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时、定期的方法验证)。第四十一页，共246页。2006年8月42根据检查方法的不同分为：细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的验证。验证的意义：

保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。

第四十二页，共246页。2006年8月43总体思路与程序某些供试品含有抗微生物物质，使供试品中的活微生物的生长被抑制，不能按常规方法检验，必须以适当的方法消除或抑制供试品中抗微生物物质的活性后，活微生物才能生长，得以检出。通过消除或抑制供试品中抗微生物物质的活性来检测微生物的方法，应通过验证，以确定所用检测方法测定结果的可信度。

第四十三页，共246页。2006年8月44需要验证的环节验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判断没有影响。前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在验证的范围内。已有标准规程（SOP）和充足实验证明的前处理方法可以直接采用，但出现疑问应进一步研究提高。

供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点第四十四页，共246页。2006年8月45供试品中抗菌活性的去除稀释法——降低供试品的相对浓度薄膜法——利用体积差异分离中和法——利用化学（生物）专属性灭活离心法——利用沉降系数差异分离

各方法组合运用，会达到更好效果！第四十五页，共246页。2006年8月46二、验证的关键点

样品：首先应是合格的样品。本底微生物太多可以先灭活，但不应因此影响药效。注意针对抽验品种本底微生物太高情况，如我们没条件进行灭活处理，可对检品适当稀释后再进行验证。（经请示专业委员会认可）第四十六页，共246页。2006年8月47检验量

指供试品一次检验的用量。一般为10g或10ml;化学药膜剂为100cm2。贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于3g）。检查沙门菌的供试品其检验量改为10g或10ml。验证实验按检验量执行。第四十七页，共246页。2006年8月48样品前处理

制剂形式多样，决定前处理各异液体供试品固体、半固体或粘稠液体供试品非水溶性供试品其他第四十八页，共246页。2006年8月49液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。第四十九页，共246页。2006年8月50固体、半固体或粘稠液体供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其它有效方法混匀，作为供试液。(常规方法）必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴适当加温使供试品分散均匀。第五十页，共246页。2006年8月51非水溶性供试品方法一

2000版已有方法（乳化法）方法二2005版新增方法（萃取法）第五十一页，共246页。2006年8月52软膏、乳膏剂先将已备妥灭菌的含司盘805g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g的混合物融化，待冷至45℃时，加入供试品5g（或5ml），立即用玻璃棒搅拌均匀，分次少量慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20供试液。第五十二页，共246页。2006年8月53油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯805~8ml，摇匀，再加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。栓剂称取供试品10g，加适量pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，置45℃水浴保温10min，使溶，加入无菌聚山梨酯805~8ml，振摇使之乳化，再加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，摇匀。

第五十三页，共246页。2006年8月54眼膏剂取供试品10g，加至20ml无菌十四烷酸异丙酯，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5~10min，静置，待油水明显分层，取其水层作为供试液。第五十四页，共246页。2006年8月55非水溶性膜剂化学药膜剂一般取样量为100cm2，置灭菌锥形瓶中，加入适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，于45℃水浴保温，浸泡，振摇，以供试品浸液作为供试液。中药膜剂取50cm2，剪碎，加入适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（通常1cm2加1ml或2ml），浸泡，振摇，以供试品浸液作为供试液。第五十五页，共246页。2006年8月56肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10g，肠溶制剂加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，结肠溶制剂加pH7.6无菌磷酸盐缓冲液至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为供试液。第五十六页，共246页。2006年8月57气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冰箱冰冻室内约1h，取出，速消毒供试品容器的开启部位周围，用无菌钢锥在容器上消毒部位钻一小孔，在室温轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1：10的供试液。第五十七页，共246页。2006年8月58茶剂取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇2～3min，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30min）。第五十八页，共246页。2006年8月59注意：以上供试品如吸水膨胀，或黏度过高，可增加稀释级的量，制成1：20～1：100供试液制备供试液所用的乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应验证，在该检验条件无抗菌作用。目标是使不便于取样的供试品分散均匀！

第五十九页，共246页。2006年8月60计数方法验证

定量——回收率测定实验

在建立供试品的细菌、霉菌和酵母菌计数方法或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，应对检查法的可靠性进行验证。验证时做规定菌的回收试验，以判断供试品是否具有抗菌活性的实验方法。第六十页，共246页。2006年8月61验证用菌株

细菌计数方法验证用菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌霉菌及酵母菌计数方法验证白色念珠菌、黑曲霉取培养物用无菌0.9%氯化钠溶液稀释成含50～100cfu/ml的菌液。第六十一页，共246页。2006年8月62要求验证实验应独立平行进行3次，分别计算各次试验菌的回收率。第六十二页，共246页。2006年8月63具体方法1)试验组2)菌液组3)稀释剂对照组4)供试品对照组第六十三页，共246页。2006年8月641.试验组平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。第六十四页，共246页。2006年8月652.菌液组测定所加的试验菌数第六十五页，共246页。2006年8月663.稀释剂对照组若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。第六十六页，共246页。2006年8月674.供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。第六十七页，共246页。2006年8月68回收率的计算

试验组的菌回收率

稀释剂对照组的菌回收率

第六十八页，共246页。2006年8月69结果判断指标

在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，按此该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。第六十九页，共246页。2006年8月70常规法

供试液的常规制备方法：

10g(ml)样品加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,制成1：10供试液第七十页，共246页。2006年8月71常规菌落计数方法的验证过程试验组：取1：10供试液1ml和菌液1ml（50～100cfu试验菌），分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。第七十一页，共246页。2006年8月72菌液组：取菌液1ml注入平皿中，倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。供试品对照组：取1：10供试液1ml注入平皿中，倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

第七十二页，共246页。2006年8月73结果判断计算试验组的菌回收率，若三次平行试验各个试验菌的回收率均不低于70%，按常规法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。第七十三页，共246页。2006年8月74培养基稀释法取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。1ml供试液可等量分注多个平皿。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。第七十四页，共246页。2006年8月75在采用培养基稀释法时，应注意避免在注皿前菌液和供试液直接接触实验组（0.5ml/皿；0.2ml/皿）每一平皿均应加1ml菌液。第七十五页，共246页。2006年8月76以1ml供试液平均分注5个平皿的方法为例说明培养基稀释法方法验证的过程10g(ml)样品加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,制成1：10供试液供试液制备方法为常规法，无需进行稀释剂对照组的实验第七十六页，共246页。2006年8月77试验组：1ml1:10的供试液等量分注5皿，平行2ml，共10皿，每皿各加1ml菌液。计算每皿平均菌数（A）供试品组（本底组）：1ml1:10的供试液等量分注5皿，平行2ml，共10皿。计算每皿平均菌数（B）菌液组：每皿加入1ml菌液，平行2皿。计算每皿平均菌数（C）回收率：（A-B）/C*100％第七十七页，共246页。2006年8月78

结果判断：计算试验组的菌回收率，若三次平行试验各个试验菌的回收率均不低于70%，按培养基稀释法测定供试品的细菌数（或霉菌及酵母菌数）。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用其他方法，如薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。

第七十八页，共246页。2006年8月79离心沉淀集菌法

1：10供试液的制备：10g样品加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，低速离心（500rpm离5分钟）去渣，取上清10ml高速离心（3000rpm离20分钟），离心后不要震摇离心管（一般用10ml带有刻度的离心管），用注射器或吸管（注意不要插到2ml刻度以下）吸取上面的8ml弃去，再加8

ml稀释液补充到10ml，混匀。第七十九页，共246页。2006年8月80试验组：取1：10供试液1ml和菌液1ml（50～100cfu试验菌），分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。菌液组：取菌液1ml注入平皿中，倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。供试品对照组：取1：10供试液1ml注入平皿中，倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

第八十页，共246页。2006年8月81稀释剂对照组：

取含菌稀释液（含菌浓度为50～100cfu/ml）代替供试品，经过低速离心后转移含菌稀释液至另一离心管中，高速离心后，用与制备供试液相同的方法吸取离心管上层8ml液体，再加8

ml稀释液补充到10ml，混匀。取此液体1ml注入平皿中，倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

要保证稀释剂对照组的操作过程与实验组完全相同！第八十一页，共246页。2006年8月82不建议使用离心沉淀集菌法操作过程不小心极易造成菌体损失，使回收率降低。某些沉降系数低的细菌可能被漏检，而验证试验无法对其验证。对某些抑菌性不强的样品建议采用培养基稀释法。第八十二页，共246页。2006年8月83薄膜过滤法供试品对照组：取规定量供试品，相当于供试品1g或1ml，如1：10供试液取10ml,过滤，冲洗（确定冲洗量），取出滤膜，菌液面朝上贴在对应培养基上，按薄膜过滤法测定其菌数。试验组：过滤量，冲洗量同供试品对照组，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。

第八十三页，共246页。2006年8月84菌液组：取菌液1ml注入平皿中，倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

稀释剂对照组：稀释液+1ml菌液混匀，过滤，冲洗（冲洗量及冲洗方法同试验组），取出滤膜，按薄膜过滤法测定其菌数。第八十四页，共246页。2006年8月85注意：如回收率仍达不到70%，首先考虑增加冲洗量，少量多次冲洗，不局限于药典所说的每次冲洗100ml。可将待过滤的样品稀释至大量稀释液中（如:500ml,多少量需在验证资料中注明）再进行过滤，这样可以减少膜对样品抑菌成分的吸附。冲洗速度不易过快，冲洗量不易过大。可与离心沉淀集菌法，中和法等方法联用。

第八十五页，共246页。2006年8月86其他消除抑菌效果的方法β-内酰胺类抗生素β-内酰胺酶奎诺酮类抗生素0.1mol/LMnSO4

第八十六页，共246页。2006年8月87当最低稀释级的供试液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法后试验菌的回收率还无法达到计数方法验证的要求时，根据供试品的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，可采用高一稀释级的供试液重新进行回收率的测定。若试验菌的回收率符合计数方法验证的要求，那么，进行供试品细菌计数或霉菌及酵母菌计数时，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液（中国药典2006增补本拟增订内容）第八十七页，共246页。2006年8月88控制菌检查方法验证

定性——能否生长、专属性实验样品给药途径和类型决定何种控制菌检查验证一般口服制剂验证大肠埃希菌外用制剂验证金葡和铜绿含药材原粉；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂的大肠菌群检查验证第八十八页，共246页。2006年8月89试验菌株按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。大肠菌群检查用大肠埃希菌梭菌检查用生孢梭菌。菌种的要求：不得超过5代。菌液制备为10～100cfu/ml。第八十九页，共246页。2006年8月901.试验组取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

第九十页，共246页。2006年8月912.阴性菌对照组

设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组。阴性对照菌不得检出。第九十一页，共246页。2006年8月92控制菌阴性对照菌株大肠埃希菌金黄色葡萄球菌大肠菌群沙门菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌铜绿假单胞菌梭菌第九十二页，共246页。2006年8月93结果判断

阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行第九十三页，共246页。2006年8月94总结一般的验证过程：第一步：常规法第二步：培养基稀释法第三步：薄膜过滤法在计数方法验证时先用常规法对5种实验菌进行预实验，如果某个或某些菌的回收率达不到70%，继续用它验证下一步的实验方法。直到它的回收率达到70%以上。这时再用5种菌进行平行试验。第九十四页，共246页。2006年8月95关于验证菌中敏感菌的选择相关文件选择原则第九十五页，共246页。2006年8月96第七届全国药品检验所抗生素室主任工作会议暨全国药品微生物检验方法及标准研讨会会议纪要（微生物检验部分）为了进一步理顺方法验证和目前监督抽验工作的关系，讨论认为应对以建立科学合理的检验方法为目的的方法验证试验和对监督抽验工作中所采用抽验方法的有效性的确认实验加以区分，具体有如下三点：第九十六页，共246页。2006年8月971.对于注册检验，如果没有合理的检验方法，应严格按照药典要求，通过完整的验证试验建立标准检验方法及SOP，所建立的标准检验方法中应确定具体的实验方法，如无菌检查中的薄膜过滤法和直接接种法，微生物限度检查中的平皿法和薄膜过滤法。标准检验方法中应有关键的实验要点，如无菌检查薄膜过滤法的冲洗条件；微生物限度检查平皿法的供试品稀释程度（0.5ml/皿、0.2ml/皿应注明）。对有抗菌作用的样品应通过验证试验确定一株敏感菌株，以供采纳该检验方法时进行方法的确认使用。第九十七页，共246页。2006年8月982.对注册检验中已有验证资料的方法进行复核时，应根据企业提供材料的情况，结合药检所掌握的情况，通过分析判断、适当的实验验证等，保证验证资料中检验方法的合理、可靠和科学。第九十八页，共246页。2006年8月993.对于目前比较突出的已上市品种的监督抽验问题，原则上应向被抽验品种的生产单位索取方法验证资料，如资料中已确定有敏感菌株，可以该菌株为阳性对照确认或调整检验方法。如果没有及时获得验证资料，或者验证资料中没有确定敏感菌株，抗生素及抗菌品种可根据其抗菌谱确立一株敏感菌株进行方法确认试验，其他品种可从药典验证菌株中选取一到两株菌快速确立检验方法，一般细菌选择枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌，真菌选择白色念珠菌，或其他有可靠依据的敏感菌株，方法确认实验可和检验同步进行。第九十九页，共246页。2006年8月100敏感菌株的选择原则首先是个动态的选择；目前针对固定品种尚未有固定或法定的方法；敏感菌株可以是一株菌，也可是两株或更多；敏感菌株不一定是药典规定的验证用菌株；由于新药生产过程中的诸多不稳定因素，对于注册品种建议按照药典规定菌株逐一进行验证。第一百页，共246页。2006年8月101针对抽验品种如资料中已确定有敏感菌株，可以该菌株为阳性对照确认或调整检验方法；可根据其抗菌谱确立一株敏感菌株进行方法确认试验；其他品种可从药典验证菌株中选取一到两株菌快速确立检验方法；一般细菌选择枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌，真菌选择白色念珠菌；其他有可靠依据的敏感菌株，方法确认实验可和检验同步进行。第一百零一页，共246页。2006年8月102抗厌氧菌的，应选择生孢梭菌；抗革兰氏阴性菌的，应选择大肠杆菌；对无明显抗菌活性的中药品种（包括注射剂），我们在实验中发现多对枯草芽孢杆菌较为敏感，而对霉菌不敏感；建议中药品种（包括注射剂），细菌首选择枯草芽孢杆菌，真菌选择白色念珠菌。第一百零二页，共246页。2006年8月1032005版《中国药典》细菌内毒素检验及方法建立山东省药品检验所2006.８济南第一百零三页，共246页。2006年8月104内容细菌内毒素概述细菌内毒素检查方法建立的指导原则细菌内毒素检查方法的建立与验证细菌内毒素检查附：中外药典细菌内毒素检查方法收载及修订情况第一百零四页，共246页。2006年8月105

细菌内毒素概述

前言

细菌内毒素

第一百零五页，共246页。2006年8月106一、前言

自20世纪60年代鲎血凝集机制的发现和鲎实验方法的建立以来，引起了各国药政管理部门的极大兴趣，并使细菌内毒素检查法在药品的热原限量控制中得到了广泛的应用和发展。尤其是与家兔热原法相比，细菌内毒素检查法具有劳动强度低，实验成本小等特点，还可以通过对原料、活性成分、灭菌水、容器、赋形剂和终产品的细菌内毒素检测，对生产过程进行质控，更明显的特点是可以定量检测药品生产过程中可能污染的痕量内毒素，并且为区分干扰作用与内毒素污染提供了极为重要的技术手段。

第一百零六页，共246页。2006年8月107二、细菌内毒素1细菌内毒素与热原的关系

注射给药过程中，偶尔会出现发热、寒战、头痛、恶心、呕吐等症状，严重的甚至昏迷、死亡，将这种药物的不良反应称之为热原反应，能引起上述热原反应的物质被称之为热原（Pyrogen）。热原与内毒素的关系在学术上仍有争论，但目前认为，在GMP的条件下，内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制细菌内毒素就控制热原物质。这也正是鲎试剂用于药物生产过程或药物成品热原检测的基础。

第一百零七页，共246页。2006年8月108过去一直认为细菌内毒素来源于革兰阴性细菌，但最近发现存在革兰阴性菌来源的不具有内毒素毒性的革兰阴性细菌脂多糖（LPS）结构。因此，目前认为所有内毒素均为脂多糖，但非所有的脂多糖均为内毒素。第一百零八页，共246页。2006年8月1092鲎试剂反应机制参与鲎血细胞凝集的成分是细菌内毒素的C因子、B因子、G因子、凝固酶原和凝固蛋白原。G因子激活的鲎试剂激活旁路，鲎试剂中的G因子可以被真菌、酵母和藻类细胞壁中另一类细菌多糖--（1，3）-β-D-葡聚糖激活，因此鲎试剂同内毒素的反应不是特异的。LPS不能激活G因子旁路。但是，鲎试剂同葡聚糖的反应与鲎试剂同内毒素的反应敏感性是不一致的。有实验表明不同的鲎试剂在检测葡聚糖和内毒素上存在很大的差异，鲎试剂与内毒素的反应更灵敏。第一百零九页，共246页。2006年8月110尽管与鲎试剂反应的物质不完全是内毒素，但目前作为鲎实验基础的两个原则仍是：1、内毒素活性与热原性相关，家兔和鲎实验作为人类发热和炎症反应的预测方法是相关的。2、在注射剂GMP生产环境下，不存在内毒素也就意味着不存在主要的热原物质。尽管存在少数例外，但依然可以使用。第一百一十页，共246页。2006年8月111C因子活化的C因子内毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白原β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM活化的G因子（旁路反应）G因子抗LPS因子凝胶法鲎试剂与内毒素的反应机理

——复杂的酶促反应过程第一百一十一页，共246页。2006年8月1123细菌内毒素标准品1.0IU=1.0EU我国内毒素参考标准品无论是在赋形剂的选择，还是标定标准和方法的使用上均与国际参考标准品取得了一致。

第一百一十二页，共246页。2006年8月1134鲎试剂凝胶反应的特征

⑴随着鲎试剂反应的进行，凝固蛋白不断增加，伴随凝聚的形成，光密度也会增加。⑵内毒素的浓度决定了光密度增加的速率。⑶凝胶形成反应呈S型曲线（分为初期的平台期、快速增长期和后期的平台期）。这些特性构成了各种检测方法的理论基础。第一百一十三页，共246页。2006年8月1145近两版中国药典细菌内毒素检查法的应用

2000年版药典内毒素检查品种增加至69种，检测方法也由单一的凝胶法增加了定量检测法。2005年版药典不但增加了112种检查品种，并且对细菌内毒素检查法进行了全面的修订，使之与美国、欧盟和日本三方协调统一的方法趋于一致。国家SFDA正组织相关专业组对2005年版药典部分进行热原检查的品种开展细菌内毒素检查方法学研究。第一百一十四页，共246页。2006年8月1156细菌内毒素检查法的方法学在方法学上，试管凝胶法已成为内毒素检查法的经典方法，并被普遍使用。但是凝胶法仍然存在着不能定量等缺点，于是随着光电子和计算机领域的进步，在凝胶法的基础上，作为细菌内毒素定量分析的比浊法和比色法逐渐发展成熟，并很快得到推广和使用，到目前为止已被许多国家的药典收载，并被统称为光度法。第一百一十五页，共246页。2006年8月116比浊法的原理是采用分光光度计检测凝胶形成过程中浊度的变化，从而定量检测细菌内毒素；比色法则是利用凝固酶水解显色底物，产生的显色基团使吸光度发生变化，以此进行定量的方法。第一百一十六页，共246页。2006年8月117两种方法又根据检测过程的不同被分为终点比浊法（EnedpointTurbidimetricAssay）、动态比浊法(KineticTurbidimetricAssay)和终点比色法（EndpointColorimetricAssay）、动态比色法（KineticColorimetricAssay）。第一百一十七页，共246页。2006年8月118凝胶法和终点法采用单一的时间点采集结果数据，决定反应在规定的时间内是否达到预定的水平。而动态法则是在适当的检测波长下监测整个反应过程的数据。内毒素的浓度决定了蛋白凝胶形成的速率，因此，通过测量达到设定光密度的时间，确定光密度随时间的改变情况，以建立光密度变化的速率与参照内毒素之间的线性关系。第一百一十八页，共246页。2006年8月119终点法中人为的加入反应终止剂，并且在此时间点读取和记录样品和标准曲线点的光密度，其缺点是：必须人为的终止反应，标准曲线的范围有限，仅为一个Log。而在动态法中光度检测仪连续的读取光密度的变化，动态监测光密度的变化，记录达到设定的光密度所需要的时间。动态法以已知的标准内毒素浓度的对数与最终反应时间的对数作图，因此，测定范围可跨越4-5个Log（一般为0.005-50EU/ml），克服了终点法的缺点。第一百一十九页，共246页。2006年8月120动态比浊法：凝胶的浊度形成是凝胶形成的前提，因此，在这个意义上浊度法其实是凝胶法的延伸。进行浊度法的鲎试剂含有凝固蛋白原的量足以在凝固酶的作用下形成浊度，但不足以形成凝胶。浊度法克服了凝胶法只能检测某一个限值水平的缺点，可以定量一定范围内的内毒素含量。现在细菌内毒素定量法的使用率在国外已超过凝胶法，大约占65%～70%，并且还在逐年上升。第一百二十页，共246页。2006年8月121细菌内毒素检查方法的指导原则方法标准物质限值的确定干扰试验检验第一百二十一页，共246页。2006年8月122一、方法细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法凝胶法为限量测定方法，光度测定法为定量测定方法凝胶法分为限量试验和半定量试验；光度测定法包括动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法两种方法可任选一种进行内毒素的检测当测定结果有争议时，除有特殊规定外，以凝胶法结果为准第一百二十二页，共246页。2006年8月123二、标准物质除另有规定外，细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作对照品应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品第一百二十三页，共246页。2006年8月124三、限值的确定1计算公式

L=K/M·······

药品人用最大剂量参考《国家药品标准化学药品说明书内容汇编》。中国人均体重按60kg计算；人均体表面积按1.55m2计算。注射时间小于1小时的，按1小时计算。第一百二十四页，共246页。2006年8月1252对于抗肿瘤和治疗心血管疾病的药物，限制可在计算出的限值基础上适当严格。3大输液类，规格≥100ml的限值可按0.5EU/ml计；规格<100ml或既有≥100ml规格又有<100ml规格的品种，限值应按《国家药品标准化学药品说明书内容汇编》中规定的有效成分的最大用量计算。第一百二十五页，共246页。2006年8月1264对于美国、欧洲和日本药典已收载细菌内毒素检查项目的品种，可参考国外药典规定的的限值，并与公式计算出的限值比较，以严格者计。如使用国外药典规定的的限值，应以最新版药典为准。第一百二十六页，共246页。2006年8月127四、干扰试验建立新品种细菌内毒素检查法时，要求至少检测三批样品（如为新药需检测连续生产的三批样品），同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂进行干扰试验。如同一样品对两个厂家的鲎试剂测定结果差异较大，应使用第三个厂家的鲎试剂。在确认该品种在某一浓度下不干扰细菌内毒素检查，或该品种在有效浓度仍有干扰作用但采用适当方法能消除这种干扰时，该品种方可采用细菌内毒素检查方法。第一百二十七页，共246页。2006年8月128对于只能使用高灵敏度才能消除干扰进行检测的品种，需慎重考虑，最好有另一实验室进行复核。药品生产厂家建立新品种细菌内毒素检查法时，应将方法学验证试验报告送国家或省级药检所复核。第一百二十八页，共246页。2006年8月129五、检验当对供试品阳性检验结果有疑义时，应考虑供试品中是否有可以引起假阳性结果的干扰因素，如葡聚糖等物质。可采用特异性鲎试剂或其它可排除干扰的方法再次试验，以判定供试品是否符合规定。第一百二十九页，共246页。2006年8月130细菌内毒素检查方法的建立

与验证影响因素信息的收集主要步骤常见的干扰因素和处理方法学验证注意事项

实例第一百三十页，共246页。2006年8月131一、影响因素

细菌内毒素检查法作为控制药品质量的有效方法，已经广泛的被世界各国药典收载。尽管经过30多年的不断改进，无论是凝胶法还是光度法均比较成熟和完善。但是，在为新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难。大输液品种遇到的问题相对较少，小针剂在方法建立中，由于小针剂体积小，药物浓度高，很容易干扰样品中添加内毒素的回收。尤其是尚处于新药研发早期阶段的化合物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样给方法建立带来不同程度的影响。第一百三十一页，共246页。2006年8月132常见的影响因素包括：样品不溶于水、样品本身具有内毒素样活性或含有内毒素（应在干扰实验前要去除）、药物的规格发生变化，药物的临床用量发生变化等。第一百三十二页，共246页。2006年8月133二、信息的收集在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂等；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量；还应了解是否为已知的鳌合剂；是否具有酶活性（如胰岛素或丝氨酸蛋白酶）；活性组分是否会在70℃水浴中被灭活，是否可能含有纤维素物质等。第一百三十三页，共246页。2006年8月134以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，尤其是对于一个正处于早期研发阶段的药物。应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查方法中对样品的稀释处理。此外，在制定限值时还应尽可能的采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。第一百三十四页，共246页。2006年8月135三、主要步骤对某一新化合物建立一个新的细菌内毒素检查方法的基本流程如图。首先根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下检验。可以采用凝胶法，也可以用终点法或动态法。第一百三十五页，共246页。2006年8月136细菌内毒素检查法建立的基本流程图药物方法建立收集药物有关信息，确定最大剂量和内毒素限值,计算最大有效稀释倍数或最小有效浓度。确定药品溶解度特性，进行预试验进行验证试验干扰无法去除选择其他方法

可能的干扰因素：PH值、蛋白修饰、非特异鲎试剂激活、内毒素污染验证试验（3批样品）建立细菌内毒素检查方法第一百三十六页，共246页。2006年8月1371内毒素限值的确定一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值要求？样品的内毒素含量是多少？与前一批的结果比较相差多少？与内毒素限值含量相差多少？这些问题不但关注用药安全，同时也考虑了生产环境的内毒素含量变化。因此，一个完善的细菌内毒素检查法的建立，除了要满足法规相关的强制性要求，保证临床用药人群的安全外，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的信息，为药品生产过程的质量控制提供警戒信息。第一百三十七页，共246页。2006年8月138尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。因此，不但要阐明限值的合理性，也要满足相关药品管理法规的要求。所以在建立方法时，不但要考虑技术可能达到的限值，也要考虑药品管理的法规要求。

第一百三十八页，共246页。2006年8月139研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式投产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费。第一百三十九页，共246页。2006年8月140相反也可以按照法规允许的最高水平，确定样品的限值，但是若标准制订的太接近法规允许的计算值，一旦产品内毒素水平超出允许范围，几乎没有警告和改善生产条件的机会，并失去日常检验对生产过程的质量监督作用。若标准制订的离法规允许的计算值较远，通过日常检测结果可以掌握内毒素含量的变化，从而为改善生产环境提供充足的时间。

第一百四十页，共246页。2006年8月141样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关，剂量越大，单位重量或体积的内毒素限值越低。一般按以下公式确定：内毒素限值=K/M式中内毒素限值是以EU/ml，EU/mg或EU/u表示；K为按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示。注射剂K=5EU/（kg.h），其中放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg.h）。第一百四十一页，共246页。2006年8月142假如我国人群平均体重按60kg计算，人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h，假如我国人体的平均体表面积按1.55m2计算，人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/1.55m2=（193EU/h）/m2

。M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。第一百四十二页，共246页。2006年8月143内毒素限值计算举例（一）：A产品的人体最大用量为每小时1.5g，每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg内毒素限值=K/M=(5EU/kg)/(25)mg/kg=0.2EU/mg因为在细菌内毒素检查法中，细菌内毒素标准品和鲎试剂均以EU/ml表示，所以在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为EU/ml的表示方法，可使实验操作计算更为方便。假定产品A的浓度为100mg/ml，或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml,那么，将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时，内毒素限值=0.2EU/mg100mg/ml=20EU/ml第一百四十三页，共246页。2006年8月144内毒素限值计算举例（二）：B产品的剂量为1g/m2，规格为50mg/ml，内毒素限值=（193EU/m2）/1g/m2=193EU/g=0.193EU/mg转变为EU/ml=0.193EU/mg50mg/ml=9.65EU/ml第一百四十四页，共246页。2006年8月145大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml，灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。内毒素限值没有考虑到几个药物联合用药问题，但一般情况下，药品中内毒素的含量远低于限值，并且药品生产厂家的内控标准严于法规标准，所以药典内毒素限值也被称为最大允许内毒素浓度（Maximumallowableendotoxinconcentration）。第一百四十五页，共246页。2006年8月1462样品溶解度的考察试验如果不清楚样品的溶解度特性，即使有了样品的内毒素限值，也不可能进行预试验，所以，必须先考察样品的溶解度。对于水不溶解样品可以考虑先溶解在合适（不破坏内毒素）的溶剂中，然后溶解在水或缓冲液中，同时确定能够使样品溶解的最佳比例和足以克服干扰的水溶液中的稀释倍数。第一百四十六页，共246页。2006年8月147样品溶液的pH值往往和溶解度相关，常需要调节溶液的酸碱性，以促进溶解。需要提起注意的是如果对样品进行了处理，同样对添加了标准内毒素的样品阳性对照也要进行同样的处理，以证明处理样品的手段没有破坏任何可能存在的内源性内毒素。第一百四十七页，共246页。2006年8月1483最大有效稀释倍数或最小有效浓度的计算最大有效稀释倍数(MVD)是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，对产品进行最大倍数的稀释，仍能够进行内毒素限值的检测。计算MVD的一般公式为：当被规定的内毒素的限值以体积表示时，MVD=（内毒素限值EU/ml）/鲎试剂灵敏度（λ）第一百四十八页，共246页。2006年8月149当内毒素的限值以重量或药品的生物活性(EU/mg或EU/U)表示时，MVD=（内毒素限值EU/mg或EU/U）×供试品溶液的浓度）/鲎试剂灵敏度(λ)在凝胶技术中,λ=鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在浊度法或显色法中,λ=所使用标准曲线上最低点的浓度（EU/ml）。第一百四十九页，共246页。2006年8月150最小有效浓度（MVC）是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，将产品稀释到最小浓度，仍能够进行内毒素限值的检测。计算MVC的一般公式为：MVC=鲎试剂灵敏度（λ）/内毒素限值对所选定的鲎试剂灵敏度MVC是一个绝对值，而MVD对特定的产品浓度是特异的，浓度变化时，MVD也会随之发生变化。第一百五十页，共246页。2006年8月1514预试验确定了样品的内毒素限值，考察了样品的溶解度，并且选定了一定灵敏度的鲎试剂，此时便可以考虑进行预试验。尽管法规中并不要求进行预试验，但在细菌内毒素检查法的建立过程中，一般要进行预试验。预试验的主要目的是确定不出现干扰的第一个样品稀释度，也就是不干扰浓度（non-interferingconcentration,NIC）,从而为后续的验证实验选择适当的样品稀释度（或浓度）。第一百五十一页，共246页。2006年8月152首先，要检查样品的pH值是否在适当的范围内，2005版药典中规定pH为。如果超出了适宜的范围时，可用无内毒素的NaOH或HCL溶液调节pH。不管采用凝胶法还是光度法，都是对一系列样品的稀释液进行试验。第一百五十二页，共246页。2006年8月153在每一个稀释浓度，都有一添加内毒素样品和一个不添加内毒素的样品，添加内毒素的浓度保持不变，而样品浓度会逐级稀释，但最终样品的稀释倍数不得超过MVD。可以直接把内毒素添加到样品溶液中，添加内毒素的体积宜小，以免导致样品溶液被稀释。一般添加体积等于或小于样品体积的10%为宜。也可以采用下述方法添加内毒素，就是将两倍于终浓度的内毒素溶液与两倍于终浓度的样品溶液等体积混合，内毒素和样品溶液间相互稀释，得到两者所需终浓度的混合液。第一百五十三页，共246页。2006年8月154添加内毒素的浓度，凝胶法为2λ（2标示灵敏度），终点比色法为4λ，这里的λ表示标准曲线上的最低点，也就是方法的检测限。动态比色法则有3种选择添加内毒素浓度的方法。可以选择标准曲线的中点浓度；也可以与终点比色法一样，选择4λ；此外，当样品稀释液中，内毒素的限值小于或等于1.0EU/ml时，添加内毒素的浓度可定为之间，当样品稀释液中，内毒素的限值大于或等于1.0EU/ml时，添加内毒素的浓度可定为之间。第一百五十四页，共246页。2006年8月155对于凝胶法的结果判断，不添加内毒素的样品不应该凝集，如果发生凝集说明含有内毒素或内毒素样物质，添加有内毒素的样品应该出现凝集，若没有发生凝集表明样品凝集反应被抑制。光度法的结果判断标准为，测得的添加内毒素的量应该在已知添加量的±50%范围内，超出范围（多或少）表明存在增强或抑制作用。第一百五十五页，共246页。2006年8月156通过预试验的结果可以确定验证试验中样品的稀释度或浓度，其选择的基本原则包括：经稀释后的样品含内毒素的量应尽可能少，比其内毒素限值至少少4倍，最好检测不到内毒素。要求验证试验选择的稀释度至少要比NIC大1-2倍，同时，不可超过MVD。第一百五十六页，共246页。2006年8月157若样品需要多支合并进行验证试验，此时试验不可采用原来的MVD。因为假定合并样品中有一瓶存在污染，其它瓶没有污染，污染瓶含有的内毒素就会被其它没有污染瓶样品所稀释，并低于MVD，从而检测不到污染的样品，因此，采用合并样品进行试验时，MVD应降低，这种情况下的MVD等于原来的MVD除以合并样品的数量。第一百五十七页，共246页。2006年8月158例如：假定鲎试剂的标示灵敏度λ为0.125EU/ml，样品的MVD为1：100。标示灵敏度复核试验：细菌内毒素标准品浓度（EU/ml）阴性对照标准品0.250.1250.06250.03125鲎试剂++---鲎试剂++---鲎试剂++---鲎试剂++---第一百五十八页，共246页。2006年8月159预试验结果结果表明样品在1：8倍稀释时，具有抑制作用，不干扰浓度（NIC）为1:16，可选择用于验证试验的稀释度或浓度为最低不小于1:32，可以选择1:64。原液1：21：41：81：161：321：641：128鲎试剂--------鲎试剂--------内毒素+鲎试剂----++++内毒素+鲎试剂----++++第一百五十九页，共246页。2006年8月1605验证试验（增强/抑制试验）验证试验在细菌内毒素方法学的建立过程中具有十分重要的作用，主要目的是确证检测内毒素的方法学不受样品的干扰。验证试验的特点是样品浓度保持不变，添加