微生物鉴定中常用的生理生化实验

微生物鉴定中常用的生理生化实验第1页/共22页实验九

微生物鉴定中常用的生理生化实验第2页/共22页一、实验目的1.证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。2.掌握进行微生物大分子物质水解实验的原理和方法。3.了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。第3页/共22页二、实验材料1.菌种枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，普通变形杆菌，产气肠杆菌。2.培养基固体淀粉培养基，明胶培养基试管，尿素琼脂试管，醋酸铅培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基。3.溶液和试剂革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂。第4页/共22页三、实验原理1.蛋白质水解试验：微生物

对大分子物质如淀粉不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，裂解大分子为较小化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，这过程可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。淀粉遇碘液会产生蓝色，在细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。第5页/共22页2.明胶液化试验：明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状态，以固体形式存在，而在25℃以上明胶会液化。有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4℃仍能保持液化状态。第6页/共22页尿素是由大多数哺乳动物消化蛋白质分泌在尿液中的废物，尿素酶能分解尿素释放出氨，这是一个分辨细菌很有用的诊断试验。尽管许多微生物都可以产生尿素酶，但它们利用尿素的速度比变形杆菌属的细菌要慢，因此，尿素酶试验被用来从其他非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分这个属的成员。尿素琼脂含有尿素葡萄糖和酚红，酚红在pH6.8时为黄色，而在培养过程中，产生尿素酶的细菌将分解尿素产生氨，使培养基的pH升高，在pH升至8.4时，指示剂就转变为深粉红色。3.尿素试验：第7页/共22页4.硫化氢试验：硫化氢试验是检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检查常用生化试验。有些细菌能分解含硫的有机物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中铅盐或铁盐等，就形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。第8页/共22页5.甲基红试验：甲基红试验是用来检测葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（pH6.3）转变为红色（pH4.2），即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡糖产生有机酸，但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。这两个细菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。因此大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。第9页/共22页6.柠檬酸盐试验：柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸是否被利用。有些细菌利用柠檬酸盐作为碳源；而另一些细菌不能利用柠檬酸盐，如产气肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会由绿色转变为深蓝色。溴麝香草酚蓝指示范围为：pH小于6.0时呈黄色，pH在6.5~7.0时为绿色，pH大于7.6时呈蓝色。第10页/共22页三、实验步骤（一）、淀粉水解实验1.将固体淀粉培养基熔化后冷却至50°C左右，无菌操作制成平板。2.用记号笔在平板底部划成4部分。3.将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别在4部分写上菌名。4.将平板倒置在37°C温箱中培养24小时。5.观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。第11页/共22页

淀粉水解试验第12页/共22页(二)、明胶水解实验1.取3支明胶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。2.用接种针分别穿刺接种枯草芽孢杆菌，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。3.将接种后的试管置于20度中培养3~5天。4.观察明胶液化情况。第13页/共22页

穿刺接种

1)手持试管。2)旋松棉塞。3)右手拿接种针在火焰上将针端灼烧灭菌接着把在穿刺中可能伸入试管的其他部位，也灼烧灭菌；4)用右手的小指和手掌边拔出棉塞。接种针先在培养基部分冷却，再用接种针的针尖沾取少量菌种。

5)将接种过的试管直立于试管架上，放在37℃或28℃恒温箱中培养。24h后观察结果注意：若具有运动能力的细菌，它能沿着接种线向外运动而弥散，故形成的穿刺线较粗而散、反之则细而密。第14页/共22页(三)、尿素实验1.取2支尿素培养基斜面试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。2.分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。3.将接种后的试管置于35°C中培养24~28小时。4.观察培养基颜色变化。第15页/共22页（四）、硫化氢试验1.用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中。2.置于37度培养48小时后，观察有无黑色硫化铅的产生。第16页/共22页（五）、甲基红试验

1.将上述两菌分别接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基中。2.置于37度培养48小时后，将1支培养基内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。第17页/共22页（六）、柠檬酸盐试验

1.将上述两菌分别接入2支柠檬酸盐斜面培养基中。2.置于37度培养48小时后，观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色，蓝色为阳性，绿色为阴性。第18页/共22页问题？第19页/共22页淀粉是逐级水解的,淀粉初步水解产物是麦芽糖,麦芽糖继续水解则水解为葡萄糖。淀粉水解是生成葡萄糖的：(C6H10O5)n+nH2O=nC6H12O6葡萄糖（C6H12O6）是多羟基醛,可用醛的性质进行检验,如银镜试验,有银白色物质生成；斐林实验,有砖红色沉淀生成.。1.不利用碘液,怎样证明淀粉水解的存在?如果不用碘液鉴定淀粉的存在,可以使用斐林试剂来鉴定是否生成了还原性糖,麦芽糖和葡萄糖都是还原性糖,淀粉则是非还原性糖.新配的斐林试剂加入到盛有还原性糖溶液的试管中,混合均匀后,将试管在沸水浴条件下加热1-2min,就会出现砖红色沉淀.如果试管中淀粉没有水解,因为淀粉为非还原性糖,将斐林试剂加入后,水浴加热不会出现砖红色；如果试管中淀粉水解了,无论是初步水解还是彻底水解,都会产生还原性糖（麦芽糖和葡萄糖都是还原性糖）,还原性糖可以与斐林试剂反应,水浴加热后,出现砖红色沉淀.第20页/共22页2.为什么大肠杆菌在甲基红反应中为阳性,而产气肠杆菌为阴性?这个试验与伏—普试验最初底物和最终产物有何异同？大肠杆菌和产气肠杆菌都属于肠道微生物,所有肠道微生物都能够利用葡萄糖作为其能量来源,但是它们的代谢途径不同,因而所产生的产物不相同。大肠杆菌利用葡糖糖发酵,主要产生混合有机酸,比如乳酸,乙酸和甲酸等,使培养基pH下降（至4左右）；产气肠杆菌利用葡萄糖进行发酵,主要产生乙醇,3-羟基丁醇和少量有机酸,培养基pH下降不很明显（6.5左右）。甲基红的变色范围为pH4.2（红）~6.3（黄）。大肠杆菌分解葡萄糖产生有机酸,培养液由原来的橘红色变成红色,因此反应为阳性；同理,产气肠杆菌为阴性。

V-P实验用于证明在糖代谢