微生物学实验基本操作与培训

微生物学实验基本操作与培训第1页/共22页微生物基本实验操作技能

要领及注意事项第2页/共22页一、无菌操作

1、无菌概念：什么地方是有菌的，什么地方是无菌的；哪些地方要求基本无菌，哪些地方严格要求无菌。

2、操作环境：实验室；接种箱；超净工作台；无菌工作室。

3、工作范围：接种、转管、倒平板、梯度稀释、涂平板、平板划线、菌体(菌悬液)转移及其他需要无菌操作的实验环节。第3页/共22页一、无菌操作4、要领及注意事项：（以实验室接种、转管为例）（1）斜面、接种环拿法；（2）火焰保护；（3）接种环灭菌；（4）接种环冷却及轻快接触斜面；（5）棉塞的制作及处理。第4页/共22页二、染色、制片

1、类型：分装片和涂片；

2、操作步骤：（以涂片为例）

1）涂片：载玻片---滴加生理盐水---挑菌涂成薄膜；

2）干燥：室温自然干燥：

3）固定：菌面向上，火焰上过2-3次：

4）染色：滴加染色液（美蓝）,覆盖（2-3分钟）；

5）水洗：自来水冲洗，至基本无色，晾干；

6）镜检：调节光源，低倍镜观察，高倍镜观察，油镜观察。第5页/共22页二、染色、制片4、要领及注意事项：（1）生理盐水和菌体一定不能过多；（2）菌膜不能过厚，最好细胞分布疏密相间；（3）固定要到位，不能残留水，也不能固定过度；（4）染色时间正确，一定要按规定计时；（5）水洗时，水流不宜过急；（6）镜检前片子一定要干燥无水。第6页/共22页三、油镜头的使用

1．工作范围：观察细菌及相近大小的微生物，真核微生物的细胞器。2、使用特点：一定要用油；操作要求较高。第7页/共22页三、油镜头的使用3、要领及注意事项：（1）所用装片、涂片上一定不能有水；（2）先用低、高倍镜观察并选好视野，并将待观察目标调至视野正中心；（3）注意保护镜头和片子，从侧面观察镜头进入油系；（4）油镜头观察时，用微调调焦距，始终按镜、片分离方向用微调调焦距；（5）调焦距速度一定要慢，避免焦躁,因为图象出现的焦距范围很小；（6）注意光线的强弱；（7）用擦镜纸蘸取溶剂（二甲苯）擦净镜头和装片。第8页/共22页四、革兰氏染色

1．工作范围：细菌学中最重要的鉴别染色法之一，也可用于其他微生物的鉴别中。一般的微生物形态观察不必用革兰氏染色。2、基本步骤：

1）初染：结晶紫染色；

2）媒染：碘液媒染；

3）脱色：乙醇脱色；

4）复染：番红复染;第9页/共22页四、革兰氏染色3、要领及注意事项：

1）菌种的菌龄，要选择生长旺盛期的典型菌体；

2）制片，按单染色的基本要求操作；

3）乙醇脱色时间是本实验成功与否的关键，注意衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约20—30秒，立即用水冲净乙醇；

4）观察时，以分散开的细菌颜色为准。

5）对未知菌进行革兰氏染色时，应选择两株形态不同、染色结果不同的已知菌和未知菌一起混合制片、染色。第10页/共22页五．细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌体形态的差别

（1）细菌、放线菌是原核生物，酵母菌和霉菌是真核生物，大小不同；（2）放线菌和霉菌是丝状菌，细菌和酵母菌是非丝状菌；（3）霉菌有孢子柄、子实体等特化形态，放线菌没有。（4）一定要注意提问，不要理解为菌落形态。第11页/共22页六、用血球计数板计数微生物的数量

1．工作范围：此法计得的是死、活菌的总数，故称总菌计数法。2、基本步骤：

1）稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液不浓，可不必稀释。

2）镜检计数室：在计数前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则进行清洗。

3）加样品：盖上盖玻片，用毛细管将菌液由盖玻片边缘滴一小滴，让其自行渗进计数室。不可有气泡。

4）显微镜计数：五分钟后，先低倍镜找计数室，后高倍镜计数。一般以每小格5—10个菌体为宜。常选四角和中央五个中格计数。格线上菌体只数上线和左边线。芽大于母体一半方计。同法计另一室。5）清洗血球计数板：自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，自行晾干。镜检，洗净为止。第12页/共22页六、用血球计数板计数微生物的数量3、要领及注意事项：（1）计数结果是微生物总数，含死、活菌；（2）菌悬液要摇匀；（3）计数格数和分布要合理；（4）对压线、出芽等情况处理；（5）菌悬液稀释要适当，不要过浓或过稀；（6）光线要适中（尤其不要太强），否则找不到计数室；（7）要先低倍镜，后高倍镜。第13页/共22页七、微生物大小的测定

1．工作范围：原核微生物的测定一般要用油镜头；真核微生物的测定一般用高倍镜即可；测微尺多用来测定细菌和酵母菌，放线菌和霉菌较少。2、操作步骤

1）目镜测微尺的标定

(1)放置目镜测微尺：测微尺刻度朝下；

(2)放置镜台测微尺：测微尺刻度朝上；

(3)校正目镜测微尺：按低、高、油顺序，使两种测微尺某一区间的两对刻度线完全重合，按下式计算：两对重合线间镜台测微尺格数×10目镜测微尺每小格长度（um）=———————————————

两对重合线间目镜测微尺格数

2）菌体大小的测定：换上装片，测出菌体长宽格数，算出菌体大小。

3）取出目镜测微尺，将两种测微尺用擦镜纸擦净，入盒。第14页/共22页七、微生物大小的测定

3、要领及注意事项：（1）镜台测微尺刻度务必朝上；（2）目镜测微尺刻度朝下，放于目镜与镜头之间；（3）按低、高、油顺序校正目镜测微尺；（4）两对刻度线要整格完全重合；（5）镜台测微尺线条太粗时，可与线条的同边对齐。（6）测细菌等原核微生物时，用油镜头要严格按油镜头的使用要求操作，要特别注意光线的强弱。（7）对不到一格的数值的判断一定要尽量准确，不能马虎；（8）对各类微生物的大小要心中有数，如计算的结果与理论值差距很大，要验算。第15页/共22页八、斜面、平板、摇瓶的制作

1．工作范围：斜面：培养和保存菌种；平板：微生物分离、纯化和活菌计数；摇瓶：微生物液体培养，模拟发酵罐。2、操作步骤：

1）按培养基配方称量各种药品、试剂；

2）斜面和平板按要求称量琼脂，摇瓶不用琼脂；

3）溶化：加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，在电热套上加热使其溶解。加入琼脂，加热，搅拌溶化，补充水分至所需的总体积；

4）调pH：测pH值，用滴管向培养基中加入NaOH或

HCl,边调边测，直至要求的pH范围；

第16页/共22页八、斜面、平板、摇瓶的制作5）分装：将配制的培养基分装入试管和三角烧瓶（250ml）内，试管装1/4。6）加塞：在管（瓶）口塞上棉塞，既保证通气又可阻止外界微生物进入造成污染：摇瓶用八层纱布盖口；7）包扎8）灭菌9）搁置斜面：趁热将试管棉塞端搁在玻棒上，使斜面长度不超过试管长度的一半；倒平板：用无菌操作的方法将三角烧瓶中的培养基趁热倒入培养皿中，6-7个/100ml；10）无菌检查：将斜面37℃恒温培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。第17页/共22页八、斜面、平板、摇瓶的制作3、要领及注意事项：

1）各种药品、试剂的称量要注意精确性；

2）微生物培养用培养基一般用自来水配制；

3）斜面的琼脂溶化要彻底；

4）调pH（除“自然”外）千万不要省略；

5）分装培养基应用培养基分装器（移液管、玻璃漏斗）分装，不要使培养基沾在管（瓶）口上；

6）倒平板时，注意避免烧、烫手。第18页/共22页九、灭菌1、操作步骤：

1)通电，打开开关，观察指示灯，视状态添加水；

2)放置灭菌物品；

3)设定温度、时间（121℃，20min），通电加热；

4)完全排净冷空气，关上排气阀；

5)灭菌结束后，切断电源，使锅内温度自然降至压力为0，打开排气阀

6)取出灭完菌的培养基、物品，自然冷却，排尽水。第19页/共22页九、灭菌2、要领及注意事项：

1）一定要检查水位；

2）温度和时间设置方法按说明书要求操作；

3）排净冷空气是关键，要理解原理；

4）应开盖蒸发一定时间后