医药代表中文评估有8-7socs3对骨质疏松大鼠

SOCS3对骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞分化的调[ ]目的探讨细胞信号负调控因子3(C3)对骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞BMCs)分化的调控及其在骨质疏松中的应用。方法建立骨质疏松大鼠模型，对BMCs进行分离和体外培养，采用SC3小发夹RAshRA)慢，BMCs。前后，以免疫组化、RTCR及Westemblo检测细胞内OC3、信号转导与转录活化因子3TAT3)、βCatenin、过氧化物酶体增殖物激活受体γperoxisomepoleatoactvatedeceptoγ,Rγ及脂联素RNA及蛋白的表达；以EIA检测前后骨保护蛋白osteopotegerin，OP和核因子B受体活化因子配体eceptoractvatorofNF-Bligand，RANK蛋白的含量，比较RANK/OP比值。结果C3shRA慢后，CS3mRA的表达被显著抑制，3的表达增强，Rγ表达下调，脂联素水平降低，OPG含量增加，RANKL含量降低，RANK/OPG比值下降<0.05。结论3可以通过Wnt/βcatenin通路及OP/RANK系统调控BMCs的分化；下调C3表达可以阻断ARγ对脂联素的作用，使脂联素水平降低，骨密度增加；抑制骨吸收，减少骨丢失，为骨质疏松的发病机制提供新的理论依据，并为该病的治疗提供新的靶点。[]细胞信号负调控因子3骨质疏松骨髓间充质干细胞信号转导与转录活化因子3过氧化物酶体增殖物激活受体γWntβcatenin通路；脂联素；骨保护蛋白；核因子B受体活化因子配体egaonadmecaimon eeaonofoemarorvedesencylsmcllsinasihoso ]ObjectiveTostudytheregilationandmechanismondifferentiationofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells(BMSCs)inratswithosteoporosis.MethodsTheanimalmodelofporosiswasestablished.BMSCswereisolatedfromtheratsandculturedinvitro.AndtheywereinfectedbyusingSOCS3smallhairRNA(shRNA)lenti .RT-PCR,westernblottingandimmunohistochemistrywereemployedtodeterminetheexpressionofSOCS3,STAT3,β-Catenin,PPAR-γandadiponeetinbeforeandaftertransfection.ThusthelevelofthesetargetswerecheckedbyWestemblot.TheproteincontentofOPGandRANKLEweredetectedbyELISA. SOCS3shRNAlenticouldsignificantlyinhibitthemRNAexpressionofSOCS3.ThentheexpressionofSTAT3increased,andWnt/β-cateninsignalpathwaywasstimulatedtolowertheexpressionofPPAR-γandadiponeetin(P<0.05).Aftertransfection,contentofOPGincreasedandRANKLdecreased(P<0.05).AndthetatioofRANKL/OPGdecreased(P<0.05).ConclusionsSOCS3mayregulatethedifferentiationofBMSCsbyWnt/β-cateninsignalpathway.TransfectionofSOCS3canblocktheroleofPPAR-γonadiponectintodecreasethelevelofadiponeetinandincreasebonemineraldensity.ItmayinhibittheboneabsorbingtodecreasetheloseofbonebyRANKL/OPGsystemItprovidesanewtheoreticalbasisforthepathogenesisofosteoporosis,andanewtargetforthetreatmentofthedisease. t/β-cateninsignalpathway；adiponeetin;OPG;RANKL作用，大量显示，干细胞功能与许多疾病的发生密切相关[1]。骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell的能力。生理状态下，BMCs向成骨细胞和脂肪细胞分化，两者之间保持着动态的平衡，当BMCs向脂肪细胞分化的能力超过向成骨细胞分化时导致骨吸收和骨形成失衡，就会导致骨质疏松症等疾病的发生[2。细胞信号负调控因子3uppessosofcytoknesignaling,OC3)可调节多种细胞因子介导的信号通路，最终影响细胞的生长、增殖、凋亡等基本生物学行为，与细胞增殖和运动等信号通路的异常活化密切相关。多项研究表明，Wntβcatenin通路、过氧化物酶体增殖物激活受体γpeoxisomeproleatoactivatedecepto-γ,Rγ、脂联素及骨保护蛋白(osteopotegerin，OP)/核因子B受体活化因子配体eceptoractvatorofNF-Blgand，RANKL系统与骨代谢及骨质疏松密切相关，但OC3与它们及其骨质疏松发病之间的关系尚未见，本研究通过建立骨质疏松大鼠模型，对BMCs进行分离和体外培养，探讨OC3对BMCs分化的调控在骨质疏松大鼠中的作用机制，为分子水平治疗该病奠定了一定的实验基础。材料与方实验动清洁级(SPF)雌性6月龄质量(220±6.32)gSD大鼠40只，由大学动物实验中心提供实验过程中对动物处置方法符合动物主要试DMEM培养液购自德国PAN-Biotech公司；胎牛、吲哚米沙星、异丁基甲基黄嘌呤购自Sigma公司；SOCS3鼠源性单克隆抗体购自Millipore公司；β-Catenin抗体购自SantaCruz公司；兔抗人总STAT3抗体购自Beyotime公司；PPAR-γ购自SAB公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自invitrogenTM公司；PCR逆转录试剂盒购自TaKaRa大连宝生物公RNA提取采用Invitrogen公司的TRIzol；OPGRANKLELISA检测试剂盒购自BiomedicaGroup，Windham，NH。实验方骨质疏松大鼠动物模型的建立上述大鼠适应性喂养1酸100mgkg注射液进行腹腔麻醉无菌条件下行双侧切除术：大鼠取仰卧位，取大鼠下腹部正中，沿腹臼线切开皮肤肌肉，打开腹腔找出双侧结扎其周围相连血管及然后切除双侧缝合伤口以75的乙醇腹腔注射青霉素以预防感3[3]。BMSCs的分离和体外培养无菌条件下取出股骨，置入75%的乙醇中浸泡30s切除两端骨骺，从一端切口向骨髓腔内注入4mLPBS缓冲液，使骨髓从另一端被冲出。将冲出液，用滴管反复吹打，离心弃10%FBSL-DMEM培养液重悬细集骨髓细胞悬液，调整细胞浓度至1.0×108/L，接种在培养瓶中，置于37℃、5%CO2二氧化碳培养箱10~14d后弃培养PBS冲洗，加入胰蛋白酶(2.5g/L)消化，待细胞变圆后加入含的新鲜培养液终止消集细整细胞2×108/L接种SOCS3小发夹RNA(shRNA)慢BMSCsBMSCs悬加入已好的慢shRNA，于37℃、5%CO2培养24h，更换新检测指标shRA慢BMSCs24h后以TRzol提取细胞总RNA，RTCR检测前后OC3、3、βCatenin、γ及脂联素RNA的表达情况48h将BMCs单细胞悬液20BS冲洗后加入40g/mlI及100g/lRNA4℃避光孵育30mn后上流式仪，2琼脂糖电泳检测CR产物。cionImage4.03软件分析CR产物灰度值Westenblot检测前后各蛋白的表达情况，以βacn为内参。OPG、RANKL蛋白的检测前后于BMSCs悬液中加入新鲜稀释的OPG、RANKL蛋白酶标抗体ELISA检测仪上450nm处测OD值，通过标准曲线计算出含量浓度。均数±标准误表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异结各的引物序列，见表1引物序列(5′→3′)

F:TCACCCACAGCAAGTTTCCR:GGATGCGTAGGTTCTTGGTC

F:AAGCTCATCTGGCTAGT

R:TTCAATCGGATGGTTCTT

F:ATCTGATTACACCAAAAGTR:

F:TCTACAATTGAGCTGCGTGTGR:GGTCAGGATCTTCATGAGGT

前后BMSCs中各蛋白mRNA的表达SOCS3素mRNA表达则明显下降(P<0.01)，见图β-β-脂联Relatively86420转染前转染图1前后BMSCs中各蛋白mRNA的表达情况，与前比较，SOCS3mRNA表达显著降低(P<0.05)，STAT3及β-CateninmRNA表达显著增强(P<0.05)，PPARγmRNA表达则明显下降(P<0.01)前后BMSCs中各PCR定量结PCR定量结果显示，与前比较，SOCS3表达显著降低(P<0.05)，STAT3β-Catenin表达显著增强(P<0.05)，PPARγ及脂联素表达则明显下降(P<0.01)，见表2BMSCsPCR定量结果前后注：vs前各组蛋白在BMSCs中的免疫SOCS3、STAT3及脂联素主要表达于BMSCs细胞胞浆，β-catenin及PPARγ主要表达于细胞核，前，BMSCs细胞胞浆可见大量SOCS3及脂联素阳性染色细胞，细胞核可见大量PPARγ阳性染色细胞；后SOCS3、脂联素及PPARγ阳性颗粒均显著减少(P<0.05)。与前相比，BMSCs细胞胞浆内STAT3及β-Catenin阳性染色细胞显著增强多(P<0.05)，见图1-5 1免疫组化检测SOCS3 2免疫组化检测STAT3 3免疫组化检测β-Catenin 4免疫组化检测PPARγ 5前后BMSCs中的OPGRANKL含量及RANKL/OPG比前后BMSCs中OPGRANKL含量及RANKL/OPG比值显著减少前后BMSCs中OPGRANKL含量及RANKL/OPG比值项 0.35±0 0.47±0 讨研究表明，BMMSC的功能异常在骨质疏松的发生中发挥了重BMSCs定向分化的研究一直是干细胞研究的热点。大量体外实验证实促进脂肪细胞生成因子表达会抑制成骨细胞[2]γ(peoxisomepolieatoactvatedeceptorγ,Rγ)是一种核激素受体超成员是脂肪生成的主要调节因子是调节脂肪形成的细胞因子和信号途径共同作用的最终环节[5]。PARγ激活后调控脂质代谢的如脂蛋白酯酶(LL，Lipopoteinlipase)、脂肪酸合成酶(ASattyacidssynthase)表型，同时可抑制BMCs向成骨细胞分化，促进其向脂肪细胞分化[6]多项显示，WntβCatenin通路可能在BMCs自我更新和定向调控中具有重要作用，该通路可促使BMCs向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化[7，同时激活Wnt通路可Rγ表达，抑制脂肪细胞生成，相反Rγ诱导可抑制该信号通路[8。SOCS3是信号转导和转录活化因子(Signaltransductionandactivatorsoftranscription,STAT)信号通路的负调控因子，我们推测如果下调SOCS3的水平，可以增强STAT3的表达，从而Wnt/β-catenin通路的传导。慢可以高效期和裂期细胞,并且可以整合到宿主细胞的组来长期表达[9]，我们的实验通过采用已经构建的慢表达载体来抑制BMSCs中SOCS3的表达结果显示，慢后SOCS3mRNA及蛋白的表达被显著抑制提示该慢病毒可有效干扰BMSCsSOCS3(P<0.05)。另外，实验结果还显示，与慢前比较，STAT3及β-cateninmRNA及蛋白的表达显著增强(P<0.05)，证实了由于SOCS3STAT信号通路的负调控因子，SOCS3表达下降，STAT3表达则增强；又因STAT3Wnt/β-catenin通路，使β-catenin表达增强。与此同时，我们推测由于激活的Wnt通路了PPARγ的表达，因此PPARγ在慢后的mRNA及蛋白的表达水平则较前显著降低(P<0.05)。Rγ不仅调控脂代谢过程中一些关键酶的表达，还调节脂肪细白质的分泌，如瘦素leptin)、Nα、胰抵抗素esistin、脂联素adiponeetn)等[10]子，是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，脂肪细胞可特异性地高表达脂联素。最近发现，脂联素可能是骨代谢的调前显著降低(P<0.05)，推测由于后PPARγ表达水平下降，减平，增加骨密度，达到治疗骨质疏松的目的研究表明，骨保护蛋白osteoprotegein，OP)和核因子B受体活化因子配体(eceptoractvatorofNF-Blgand，RANKL)参与了成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡，且OP、RANKL之间的比例在破骨细胞的形成和功能及骨形成和骨吸收上起着重要的调节作用2]。在BMSCs向成骨细胞分化的过程中，RANKL/OPG的比值不断化，该比值随着成骨细胞的分化成熟而逐渐缩小，从而丧失促进破骨细胞分化和激活的功能，使骨吸收和骨形成两个过程紧密相连并达到平衡[13。Mille[14]，皮射外源性OP药物可显著降低绝经后妇女的骨转换标志物水平，增加其骨密度。本实验结果显示，BMCs慢后，其OP含量显著增加，RANK含量则显著减少<0.05，同时RANKL/OPG比值显著缩小(<0.05，骨吸到抑制，骨丢失也因之减少。另外，由于由此推测OC3还可能通过调控OPG/RANKL系统调节成骨细胞与破骨细胞、骨形成及骨吸收之间的动态变化，从而调节骨代谢。综上所述，C3可以通过Wntβcatenin通路调控BMCs的分化；下调C3表达可以阻断ARγ对脂联素的作用，使脂联OC3还可能通过调控OPG/RANKL参考文RossiDJ，JamiesonCH，WeissmanIL.Stemscellsandthepathwaystoagingandcancer[J].Cell,2008,132(4):681-696MahajanA,StahlCH.Dihydroxy-cholecalciferolstimulatesadipocyticdifferentiationofporcinemesenchymalstemcells[J].JNutrBiLiLiang.TheEffectofmechanicalstimulationontheosteoblastfromosteoporoticrat.(cellular-molecularbasisresearch)SichuanUniversity,Chengdu:GraduateCollegeofSichuanUniversity,2004:28MuruganandanS，RomanAA，SinalCJ.Adipocyteonofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells:crosstalkwiththeosteoblastogenicprogram[J].CellMolLifeSci,2009,66(2):236-3RosenED,MacdougaldOA.Adipocytedifferentiationfromtheinsideout[J].NatRevMolCellBiol,2006,7(12):885-896TakadaI,KouzmenkoAP,KatoS.Molecularswitchingofosteoblastogenesisversusadipogenesis:Implicationsfortargetedtherapies[J].ExpertOpinTherTargets,2009,13(5):593-603ChenY,AlmanBA.Wntpathway,anessentialroleinboneregeneration[J].CellBiochem,2009,106(3):353-362[9]TakadaI,KouzmenkoAP,KatoS.WntandPPARg alinginosteoblastogenesisandadipogenesis[J].NatRevRheumatol,[8]PfeiferA,EigenbrodS,Al-KhadraS,etal.Lentivector-dRNAiefficientlysu